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![Tm值的计算公式 tm值计算方法](http://img.hubeilong.com/220625/0430526217-0.jpg)
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做过分子实验的人都知道 , 要想做的有效率有质量是很苦逼的 , 1个月做100个克隆那都是小case , 没点看家的本事怎么行 。如果再遇到比较极品的稀有基因 , 周旋个把月 , 那也是家常便饭 。下面就和大家分享一些载体构建的经验 , 从此迈向科研达人:
1. 准备工作
俗话说:用欲善其事 , 必先利其器 。建议大家在做构建之前先找好工具 , 效果事半功倍哦 。推荐两个工具 , 一个是oligo软件 , 常用于引物设计和酶切位点分析;另一个是DNAstar软件 , 工具极强大 , 一款全面的生物医学软件 , 用作DNA和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理 。
2. 设计引物
1) 注重要:看懂质粒图谱!拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子 。
想用N1质粒 , 设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉 , 不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白 , 你就死了;C1质粒 , 注意阅读框 , 要是移码了 , 你也死了 。而且PEGFP系列有1.2.3 , 要弄清楚别弄窜了 。一句话 , 要看懂你的图谱!
其他需要注意:
3. PCR扩增
如果没有现成的质粒可供酶切 , PCR是最理想也是最方便的策略 。目前市面上可选择的PCR酶实在太多 , 每隔一段时间还会升级 , 正常情况下 , 高保真的taq酶都能满足需求 。但如果遇到难PCR的高GC基因 , 可以换不同PCR酶 , 添加一些 DMSO , 甘油等 , 实在不行可以考虑Clontech的2 GC rich kit , 价格和实力都大牛 。另外 , 建议电泳切胶回收纯化PCR产物 , 去除一些非特异性条带 。
强烈推荐NEB的内切酶 , 记得有一次用别家的酶切过夜 , 结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高) , 而用NEB的酶 , 切个七十二小时仍旧一切OK , 尤其现在NEB还推出了HF的内切酶 , 没有星活性而且统一都用Buffer4 。另外TAKARA的酶也还可以 。
最常用的是NEB的T4连接酶 , 很好用 , 但是注意Buffer里有ATP , 反复冻融ATP失活很快 , 拿到buffer后就分装 , 10uL/管 , 一次性使用 。
载体总量:一般来说 , 载体浓度在20-100ng/uL较好 , 太低的话碰撞几率低 , 太高的话又会产生很多非目的克隆 , 总量从50-100ng就可以 , 太低失败几率很高 , 太高克隆太多 , 挑克隆会很麻烦 , 反应总体积也有讲究 , 体积太大载体和目的片段碰撞几率太低 , 而且对感受态细胞也是个挑战 , 通用10-15uL 。
载体和插入片段比例:载体和插入片段比例一般是1:7 , 如果很难连接 , 比如说平端连接 , 要适当提高片段浓度 , 同时加大比例1:10 。
按照SOP做就行 , 话说实验室原来从takara买感受态(competent cell) , 后来发现还是自己做的效率高(protocol免费索取) 。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素 , 实验室原来有个技术员 , 做一次失败一次 , 我就奇怪了 , 后来才发现他用的居然是加了kana的LB , 直接晕过去了 。
想要快速鉴定 , 建议用菌液PCR , 菌液PCR是有一定讲究的 , 很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多 , 为什么?因为你PCR引物选的都在载体上 , 注意引物必须分别在载体和插入片段上才准 , PCR方法鉴定是极其准确的 , 数百次菌液PCR经验 。PCR鉴定做起来也很简单 , 拿个2mL tube , 装0.5mL 加入相应抗生素的LB , 摇个三小时左后取1uL做模板就行了 。如果想更快 , 直接菌落PCR也不错 , 效果一样 。
拿到测序结果时 , 不仅要核对序列 , 还要看测序峰图 , 这很重要 。因为有时候光看序列对 , 实际上图显示的不对 , 或者虽然序列结果不对 , 但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信 , 出现突变也不怕 , 有很大可能性是简并密码子;
还要重点检查的地方就是“接头”的地方 , 因为偶尔引物会出错 , 比方说少个碱基什么的 , 还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的 , 如果不仔细检查到了后期悔之无及 。
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