《自然》：抗癌能用的新抗原，比我们想的多多了！( 二 )

于是，根据免疫肽组的时序变化， Jacks团队进一步分析了肿瘤进展对免疫肽组的影响及其相关的生物学特征。在KP模型中，他们观察到了多肽特征的动态变化，且肿瘤晚期特征与胃上皮模块、高度混合转录基因模块的相关性增加（图4g-h）。
GSEA分析表明，晚期肿瘤多肽特征与炎症细胞因子信号通路正相关，与Myc信号通路、代谢过程和上皮-间充质转化（EMT）负相关（图4i）。此外，他们还关注了KP肿瘤细胞的转移簇特征，说明了MHC-I呈递存在显著的肿瘤内和肿瘤间异质性（图4j-k）。

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图4LUAD免疫肽组在整个肿瘤进化过程中是动态的和异质的
前面的探索虽然阐明了来自KP肿瘤的广泛免疫肽组特征，但并未说明与健康的肺或正常AT2细胞相比， KP肿瘤中特异的肽的特征（图5a）。因此，为了了解转录过程和LUAD特异性肽呈递之间的关系，他们将LUAD进展过程中编码LUAD特异性肽的基因的相对mRNA表达水平，与正常AT2细胞中的进行比较，发现LUAD特异性肽的呈递效率与平均mRNA表达水平或预测的肽亲和力均无关（图5b）。
这也就意味着， mRNA表达的变化不能完全解释单个肽的LUAD特异性呈递效率。 Jacks团队通过对肿瘤进展任何阶段都上调的基因进行鉴定，及对其相应多肽的亲和力进行预测，最终只有39个为LUAD特异性肽，这也证明了以往使用RNA表达水平或亲和力预测等方法筛选肿瘤特异性抗原肽的局限性（图5c）。
相应地， Jacks团队还评估了肿瘤细胞或正常细胞中的蛋白质合成是否可以更好地预测LUAD特异性肽的呈递。他们获得了正常AT2细胞和KPLUAD细胞的类器官培养物，并在体外进行了核糖体分析（Ribo-seq）和转录组测序（RNA-seq）。分析结果表明，与这两种类器官各自特征相关的基因均表现出更高的翻译率（图5d-e）。
【《自然》：抗癌能用的新抗原，比我们想的多多了！】综合分析Ribo-seq、RNA-seq数据后， Jacks团队发现，有些基因在两种类器官之间有明显的mRNA或RPF（RibosomeProtectedFragment）丰度差异，但编码LUAD特异性肽的基因却通常没有差异，且通过TE（TranslationEfficiency）预测所得的肽与LUAD特异性肽的重复率非常低（图5f-g），这也就是说，通过蛋白质合成也不能很好地预测肿瘤特异性抗原肽。

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图5LUAD特异性多肽的转录和翻译
最后， Jacks团队在KP/KbStrep模型中发现了135个推测的非突变肿瘤特异性抗原（TSAs）和147个推测的肿瘤相关抗原（TAAs）（图6a）。
为了验证这两类抗原的免疫原性，他们用一种混合肽树突状细胞（DC）疫苗（3种TSAs ， 5种TAAs）接种小鼠，并使用ELISpot技术检测IFN-γ的分泌（代表着T细胞的应答水平，侧面反映抗原的免疫原性）；最终他们发现了三种免疫原性肽，其中两种是无法在体外筛选到的，且难以通过RNA或RPF的表达进行预测（图6b-d）。
进一步，他们利用tetramer技术对接种了5周疫苗的KP荷瘤小鼠的CD8+T细胞反应性进行评估（图6e-f），证明了被激活的T细胞确实能识别特定序列的肿瘤抗原肽。对其余五个缺乏免疫原性的多肽，他们也进行了分析，这些多肽在健康小鼠中被发现主要集中于AT2细胞，而在广泛的肺组织中则表达很低，从而导致了错误的推测（图6g）。
以上分析也表明，与体外或芯片筛选方法相比，体内的细胞特异性免疫肽组学提供了通过经验评估细胞特异性和组织特异性呈递模式的机会，并能更准确地分类潜在抗原（图6h）。