治疗|基因治疗在IVA型粘多糖病中的应用模型|股骨|骨骼|疾病|系统|胫骨

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IVA型粘多糖病（MPSIVA）又名Morquio A病，是由N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶（GALNS）缺乏引起的，导致硫酸角质素（KS）和硫酸软骨素-6-积累。患者会出现严重的骨骼发育不良、早期软骨退化以及危及生命的心脏和气管并发症，但目前尚无治愈方法。
基因治疗作为一种新兴的疗法，通过AAV等递送系统补偿突变基因的效价，在众多罕见病治疗上展现出巨大的应用潜力。 Bertolin等人在MPSIVA疾病模型中注射AAV9-Galns ，发现GALNS的活性能长期（1年）恢复，并且KS的表达水平恢复正常，从而改善MPSIVA的症状。这项研究证明AAV9-Galns基因治疗在治疗MPSIVA的应用潜力，为MPSIVA患者未来的临床治疗提供了强有力的理论基础。
接下来我们就详细解读这篇文献，再深入理解基因治疗研究的常规套路吧。
研究思路
01 构建MPSIVA大鼠疾病模型
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02 AAV9递送系统的递送效率检测
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03 MPSIVA大鼠疾病模型的表型检测与注射AAV9-Galns后的有效性评价
MPSIVA大鼠疾病模型的构建
作者利用CRISPR/Cas9技术构建含有错义突变c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型并且通过测序分析验证了该点突变， GALNS点突变的产生导致GALNS蛋白的功能发生突变（p.Arg386Cys）。研究人员将杂合子大鼠（GALN+/?）与野生型大鼠（GALN+/+）回交，以消除CRISPR/Cas9相关的脱靶效应（图1a-c）。对GALN敲除大鼠进一步分析，发现在这些大鼠所有的组织中均无法检测到GALNS活性水平，并且早在1个月大时，肝脏和血清中的KS含量一直很高，胫骨长度减少（图1d-g）。

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图1. MPSIVA大鼠疾病模型的构建。
AAV9在骨骼系统中具有良好的递送效果
由于MPSIVA疾病的基因治疗面临的主要挑战是没有良好的递送系统，以增加局部GALNS的浓度。作者将AAV9-GFP注射至野生型雄性大鼠，通过观察荧光强度来评价AAV9递送系统的效率。在股骨、胫骨生长板（GP）和骨内膜周围的成骨细胞富集区、致密骨的内部细胞和关节软骨中检测到GFP阳性信号（图2a）。
此外，在所有大鼠骨骼（股骨、胫骨、前肢骨、胸骨、肋骨和椎骨）和Morquio A大鼠的关键外周器官中也发现了高水平的GFP表达（图2b、c）。
然后对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns ，载体基因组拷贝数分析表明， AAV9-Galns在骨骼（图2d）和外周器官（图2e）中有较好的转导效率。表明AAV9在治疗MPSIVA上具有很大的应用潜力。

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图2. AAV9在骨骼系统中具有良好的递送效果。
A. (I)致密骨(CB)； (II)生长板周围区域(GP)；(III)关节；(IV)骨小梁；(V)骨内膜。 B. F ，股骨；Ti ，胫骨；R ，肋骨；S ，胸骨；V ，椎骨；FL ，前肢骨骼；K ，膝盖骨；Fi ，腓骨；Sc ，肩胛骨；Hu ，肱骨；T ，气管；H ，心脏；L ，肝脏；A ，附睾白色脂肪组织（eWAT）；Lu ，肺；Q ，股四头肌。
注射AAV9-Galns能有效治疗MPSIVA
身材矮小是MPSIVA患者的特点。 MPSIVA雄性大鼠在第一个月龄期间显示出与WT大鼠相似的体重，但随后观察到体重和体型的显著下降（图3a、b）。并且MPSIVA大鼠的寿命也显著缩短，约30%的大鼠在2个月大时死亡（图3c）。
经过AAV9-Galns基因治疗， MPSIVA大鼠的体重增加且存活率恢复正常（图3a-c），并且GALNS的活性和KS的水平恢复正常（图3d-f）。在肝脏和白色脂肪组织（WAT）中也发现GALNS活性较高（图3g、h）。 GALNS活性提高使肝脏中KS含量正常化，仅储存在Kupffer细胞和WAT中（图3i-l）。此外，肝脏β-己糖胺酶（溶酶体内稳态生物标记物）活性恢复（图3m）。