治疗|基因治疗在IVA型粘多糖病中的应用( 二 ) 模型|股骨|骨骼|疾病|系统|胫骨

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图3. 注射AAV9-Galns能有效治疗MPSIVA 。
AAV9介导的Galns表达可防止骨骼病变
对MPSIVA大鼠使用AAV9-Galns ，可增加Galns在骨骼中的表达，如股骨、胫骨和肱骨（图4a），可以降低GP和骨干中的KS累积（图4b-d）。
2个月大的MPSIVA大鼠的GP软骨切片显示GP面积和钙化区均显著减少，表明随着大鼠年龄的增长，骨化发生了变化（图4e）。对MPSIVA大鼠胫骨GP的分析显示，静止区和增殖区的软骨细胞肥大， AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠的软骨细胞肥大明显减少（图4f）。
透射电子显微镜（TEM）进一步证实了这一点，证明接受治疗的动物增殖软骨细胞中的储存液泡大量减少（图4g）。这些结果与AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠中观察到的体型正常化一致（图3a、b）。
经MPSIVA治疗的大鼠显示正常的骨密度和含量，以及小梁厚度、数量和间距。相反，未经治疗的MPSIVA大鼠的所有骨参数均发生改变（图4h-j）。这些结果为这种基因疗法治疗MPSIVA病的骨病理学提供了强有力的证据。

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图4. AAV9介导的Galns表达可防止骨骼病变。
使用AAV9-Galns治疗可防止牙齿异常改变
牙齿异常改变是MPSIVA患者的常见特征。在2个月大的MPSIVA大鼠中，牙齿错牙合、脆性和釉质发育不良已经很明显（图5a）。相反， AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠门牙完整，咬合和釉质正常（图5a）。
通过下颌骨切片中门牙的LIMP2免疫染色显示，产生釉质的成釉细胞和乳头层细胞中存在明显的溶酶体扩张，导致釉质发育不良（图5a、b）。 AAV9-Galns治疗纠正了这些细胞的储存病变（图5b）。 MPSIVA大鼠切牙的超微结构分析显示成釉细胞中有大量的储存液泡。在使用AAV9-Galns基因治疗后，病理性溶酶体积聚降低（图5c）。

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图5. AAV9-Galns基因治疗可防止牙齿异常改变。
AAV9-Galns基因治疗关节软骨病变
KS累积改变MPSIVA患者的关节软骨，导致严重的骨关节炎，最终需要骨科手术。在4周龄的MPSIVA大鼠中，与WT大鼠相比，用藏红O染色和LIMP2免疫染色对胫骨软骨切片的分析发现软骨细胞肥大增加（图6a-c）。在8周龄时，在MPSIVA大鼠的关节软骨切片中观察到LIMP2信号加剧，这与进行性KS积聚和溶酶体扩张一致（图6d、e）。对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns ，可显著纠正关节软骨中的储存病变（图6d、e）。并且在治疗后，死亡率显著降低（图6f）。
对6个月大的MPSIVA大鼠肱骨软骨切片进行组织学分析，并用藏红O染色，发现存在骨关节炎，在关节软骨最浅层有大量肥大软骨细胞（图6g）。注射AAV9-Galns能够减少该层中肥大软骨细胞的数量（图6g）。胫骨关节软骨表层软骨细胞的超微结构分析显示，与未经治疗的动物相比， AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠减少了储存囊泡（图6h）。
对MPSIVA大鼠给药11个月后，发现软骨细胞肥大程度减少，并防止了膝关节软骨丢失（图6j、k）。这与注射AAV9-Galns的大鼠关节软骨中基质金属蛋白酶表达的正常化一致，有助于骨关节炎的预防（图6l）。此外，在滑膜中观察到的溶酶体扩张在AAV9-Galns治疗后正常化（图6m）。与关节改变一致， MPSIVA大鼠在2个月大时已经表现出握力下降（图6i）。 AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠表现出与WT大鼠相似的行为（图6i），这表明AAV9-Galns基因治疗可改善MPSIVA的骨关节炎病变。