肿瘤|浙大和药大团队发现肠癌细胞竟会“丢弃”抑癌因子( 二 ) 环状|因子|基因|研究|患者|肿瘤

他们还发现circRHOBTB3的结合蛋白是ENO1和ENO2 。也就是说， circRHOBTB3可能通过与ENO1和ENO2等代谢酶相互作用，调节细胞内ROS水平，抑制肿瘤细胞增殖和EMT 。
为了验证circRHOBTB3在体内的功能，研究人员将过表达circRHOBTB3的HCT116细胞（CRC细胞系）皮下注射到裸鼠体内，构建了异种移植瘤模型。研究发现，与不表达circRHOBTB3的对照（EV）组相比，circRHOBTB3过表达（circRHOBTB3-OE）组的肿瘤体积和重量都显著更小，且细胞增殖能力也更弱（图4A、B、C）。
而当他们在裸鼠脾脏接种实验中观察肝转移表型时发现，circRHOBTB3-OE组肝转移灶少于EV组（图4D、E）。更为有趣的是， circRHOBTB3可以在异种移植瘤小鼠模型的血浆和尿液中检测到，而在野生型小鼠的血浆和尿液中则没有。此外，circRHOBTB3-OE组的血浆中circRHOBTB3的水平高于EV组（图4F、G）。

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图4 circRHOBTB3功能的体内验证实验
根据这些数据，研究者们推测 CRC细胞必须通过外泌体分泌抑制肿瘤的circRHOBTB3来维持肿瘤侵袭和转移的特征，换言之， CRC细胞有特殊的“排毒”机制。
在随后的研究中，研究人员发现了circRHOBTB3的环化机制，还发现circRHOBTB3本身的顺式元件（141–240nt ， 141-165nt ， 216-240nt）可以调节circRHOBTB3通过外泌体的分泌过程（图5）。

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图5 转染了截断的circRHOBTB3载体的细胞中circRHOBTB3外泌体分泌丰度
之前已经有研究发现， ESCRT-II亚复合物作为一种RNA结合复合物，可以将RNA分选至外泌体[8]中。在该文研究中，他们发现 SNF8可以结合到circRHOBTB3的141-240nt区域，促进circRHOBTB3被分选至外泌体并分泌到胞外。他们将这个过程被定义为“肿瘤外泌体逃逸机制”（图6）。
图6 SNF8敲低实验以及外源的RIP实验
受上述研究结果启发，研究人员设计了二代ASOs ，以增加circRHOBTB3的环化并减少分泌，这有望成为一种新的癌症治疗策略。
研究人员设计了三种二代ASOs：一个靶向负环化的元件（ASO-cir：266-290nt）和两个外泌体分泌的元件（ASO-exo1：141-165nt ， ASO-exo2：216-240nt）（图7）。
通过实验他们发现， ASO-cir确实能增加circRHOBTB3的环化，但circRHOBTB3的分泌却会同时增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，仅ASO-exo2 （以下简称ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞内水平，又阻断circRHOBTB3外泌体的分泌。因此，研究者们考虑进一步使用ASO-cir和ASO-exo ，研究二者联合治疗对结直肠癌的特异性和抗肿瘤效果。

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图7 二代ASOs及其作用机制
研究人员验证了ASOs的联合用药的确比ASO-cir和ASO-exo的单独用药能产生更多的胞内circRHOBTB3 ，且小鼠实验的结果符合预期：ASO-cir联合ASO-exo确实显著提高了脾脏原发病灶中circRHOBTB3的表达，还可显著减少肿瘤恶病质，且能控制转移（图8）。

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图8 ASOs体外及体内实验
总的来说，这项研究成果阐明了circRHOBTB3调节细胞间ROS和代谢途径来抑制CRC的进展的机制，还且提出了一种新的肿瘤逃逸理论，即肿瘤细胞通过“排泄”肿瘤抑制circRNA来维持癌细胞的活性（“肿瘤外泌体逃逸机制”）。