酵母双杂交酵母双杂交实验 _知识经验

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1、酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i。
2、典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain) 。
3、前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
4、二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
5、而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
6、酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
7、主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
8、上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
9、融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
10、例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenc[利用酵母双杂交筛选基因]利用酵母双杂交筛选基因e)，而GAL4-ad没有。
11、因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
12、目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
13、常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
14、双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
15、报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
16、最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
17、〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
18、〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
19、一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16) 。
20、激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
21、酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
22、主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
23、②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
24、③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
25、④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
26、同时，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
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