空间转录组学新突破：摆好聚光灯，让RNA自己说话！( 二 )

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【空间转录组学新突破：摆好聚光灯，让RNA自己说话！】图3Light-Seq的概览（图源：[2]）
Light-Seq项目由Jocelyn（Josie）Kishi博士、SinemSaka博士和NinningLiu博士以及EmmaWest博士牵头。 2019年， Kish、Saka和West共同开发了一种名为SABER-FISH的空间转录组学方法，该方法用于直接在完整组织中对基因表达进行成像，能够在固定的细胞和组织中将RNA和DNAFISH信号放大5到450倍。尽管如此， “距离捕捉细胞完整的基因表达程序还有好几个数量级的差距。每个细胞有数千个不同的RNA分子， RNA分子过于密集，无法用目前的成像技术完整捕获。 ”Kishi说， “而Light-Seq借助更高分辨率的DNA标签和NGS全转录组测序，两全其美地解决了这个问题。 ”
首先， DNA引物与细胞中的RNA分子进行碱基配对，以RNA为模板扩建出RNA的副本，即互补DNA（complementaryDNA ， cDNA）。然后，通过紫外光的照射，将含有超快光交联剂的标签DNA通过光交联反应“粘到”目标区域的cDNA上，而未被紫外光照射的区域，标签DNA会在之后的步骤中被洗脱，这样就对感兴趣的区域打上了标记。若是使用不同的标签配合照射不同区域的紫外光重复该过程，则能标记更多的区域。

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图4DNA光刻进行空间寻址标记（图源：[2]）
接下来，为了使NGS能够读取到“贴好标签“的目标cDNA序列，使用特定的酶水解了RNA-cDNA杂交体中的RNA ，将“贴好标签”的cDNA提取出来。随后，利用研究人员新开发的一种基于纳米驱动技术的拼接反应，将标签DNA和目标cDNA序列一起“抄录”到新的DNA单链中。这些新的DNA单链则可以用于后续的NGS测序（图5）。

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图5拼接反应与Light-Seq的工作流程（图源：[2]）
为了验证该技术的细胞选择能力和“贴标签”的能力，研究人员将小鼠3T3细胞和稳定表达eGFP的人类HEK细胞混合进行测试。基于eGFP表达和细胞形态信息，研究人员对细胞进行了手动选择并标记以不同的“标签” 。结果表明，小鼠和人类图谱对于其各自的“标签”具有良好的区分率，尤其是eGFPreads归类到人类“标签”的正确率高达93±0.5% 。序列提取后，又对样本进行了多重免疫荧光，验证了样本具备进行二次分析的完整性。
在培养细胞中首次验证Light-Seq之后，研究人员希望将其应用于更复杂的组织，因为组织样本中特定细胞群的RNA测序仍然充满挑战性，尤其是当靶细胞很少或难以分离时。为此， Kishi ， Saka ， Liu和West联手，将Light-Seq应用于小鼠的视网膜切片。研究人员手动划分了视网膜经典具备不用功能的三个细胞层。结果表明， Light-Seq达到了与单细胞测序方法相当的序列覆盖率，并发现视网膜的三个主要层之间富集了数千个RNA（图6）。此外，样本保持了完整，仍能进一步对蛋白质和其他生物分子进行成像。

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图6LightSeq应用于小鼠视网膜切片（图源：[2]）
将Light-Seq发挥到极致，研究人员分离出了一种非常罕见的细胞类型的完整转录组，这种细胞与视网膜内的其他细胞联系极其复杂，因此难以分离。 “Light-Seq还提取了该细胞中表达水平极低的特异性RNA ，以及据我们所知前人从未描述过的数十种特异性生物标志物RNA ，这为研究这种罕见细胞类型开辟了新的机会。 ”West说。
将空间转录组学领域向NGS敞开还带来了有关单个RNA种类水平的信息。 Kishi表示：“Light-Seq可以确定RNA结构的自然变异。 ”展望未来， Kishi对Light-Seq应用于更好地了解免疫系统、疾病传播细胞以及基因和细胞治疗等不同治疗策略之间的相互作用充满兴趣，现在，她正积极地与合作者们一起寻求将Light-Seq商业化的道路。