PDX模型联合CRISPR/Cas9筛选儿童急淋化疗耐药治疗靶点( 三 ) _健康小知识

研究团队发现获得性耐药是一种稳定的特征，推断基因组改变可能是耐药表型的基础，于是他们对ALL-199来源的样本（种系对照），包括患者健康的骨髓细胞、ALL-199供体PDX模型，未处理PDX细胞及ALL-199来源的耐药株D1-D8进行全外显子测序来比对体细胞改变与耐药相关改变。对照组PDX模型中检测到染色体1、6、7、9、13、14、17和19上的体细胞拷贝数改变(CNA) ， D1-D8耐药株染色体上出现了1,6,17和X拷贝，它们大多是以单独的组合出现（下图C），包括染色体短臂的部分缺失。值得注意的是，在供体样本中17q扩增，位于17p上的基因有两个拷贝，而在未处理的样本中， 17q上的基因有三个拷贝。同样的染色体改变也在其他来源模型中出现，说明经过长期化疗，耐药株存在明显的单一克隆并具有异质性。
接着，研究团队详细分析了ALL-199耐药株位于1号和17号染色体上常见单核苷酸多态性(SNP)的变异等位基因频率(VAFs) 。耐药株D4-D8中，观察到反复的1p缺失， 1p36基因的下调可能有助于耐药性的形成。有趣的是， ALL-50耐药株中都发现反复突变的RPL22正好位于1p36上，表明1p36基因在两种PDX耐药发展中都发挥了重要作用。 D1和D2缺失17号染色体不同的等位基因（下图E/F），肿瘤抑制因子TP53位于17号染色体的短臂上，耐药株D1和D2在VAFs分别为95%和82%时，在TP53的单个等位基因上分别携带了不同的突变， p53功能丧失可能有助于亚克隆的耐药。总而言之，耐药株之间存在异质性克隆，不同耐药株间都有明显的染色体和基因组改变。
为了探讨不同的基因组改变是否存在共同表达谱特征，研究团队对未处理、敏感组、持续组和耐药细胞的转录组及蛋白质组学进行分析(下图G) ，在耐药组和未处理组细胞中，共有525个基因显著下调，其中273个基因显著上调， 252个基因显著下调(下图G、H)；蛋白质组学171个显著下调的蛋白质中， 85个蛋白质在耐药株中显著上调(下图I/C);转录组及蛋白质组基因集富集分析表明耐药株有细胞粘附、上皮-间充质转化、p53通路或缺氧等富集，但未达统计学差异。
ALL-PDX获得性耐药模型基因组改变呈异质性，但具有共同特征表达谱。 A.实验总体设计。 ALL-199生殖系对照，取自患者健康的骨髓细胞、ALL-199供体PDX模型，未处理细胞及ALL-199来源的耐药株D1-D8进行全外显子测序比对体细胞改变与耐药相关改变。 B、C.供体ALL-199与耐药细胞模型之间的基因组变化情况。 D3因获取细胞数不够而数据剔除。 D、E.对1号和17号染色体变异等位基因频率进行分析。每个点代表以hg19为参考确定的SNV 。水平虚线表示VAF=0.5 ，垂直虚线表示着丝粒位置。 F.染色体分布示意图表示。供体PDXALL-199(浅灰色)中有17号等位基因，其中一个等位基因为chr17q重复，在耐药株D1-D2中(红色) ，其中两个完染色体有17号等位基因丢失。
耐药株共同存在失调控基因和蛋白，反映了在异质基因组变化背景下的相互耐药表型。异质性耐药株间共同基因表达谱特征变化，可能是克服联合化疗获得性耐药性的治疗机会。研究团队采用CRISPR/Cas9慢病毒转导敲除功能基因筛选技术对PDX模型进行体内筛选，在ALL-199转录组和/或蛋白质组上调的候选基因中筛选了223个蛋白质编码基因1196个sgRNAs做后续验证。分别获取了移植前细胞（Input）、治疗开始前（Treatmentstart）、未用药（3周PBS处理）及用药组样本进行后续分析。其中，前三组中缺失的sgRNA认为是白血病细胞生长和生存所需的必需基因（下图C）；仅在用药组发现的缺失基因才认为是对治疗敏感的基因(下图C右) 。在D7模型中， TBX21、BCL2、SCN1B、CSNK2A1和BRIP1基因完全缺失；COPS2基因在D7和D5两个耐药模型筛选中均消失(下图D) ，而这些基因在转录组RNA水平上(TBX21、SCN1B、CSNK2A1、BRIP1、COPS2)或蛋白质水平上(BCL2、COPS2)显著上调。