快报 | 乙酰磷酸（AcP）介导cAMP受体蛋白（CRP）的乙酰化调控分枝杆菌的毒力

作者：中国防痨杂志期刊社
作者：狄玉昌，徐思悦，迟明哲，胡酉炜，张潇，王洪海，张文宏，张雪莲
第一作者及单位：狄玉昌复旦大学遗传工程国家重点实验室/生命科学学院/上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室/国家传染病医学中心
通信作者及单位：张雪莲，张文宏复旦大学遗传工程国家重点实验室/生命科学学院/上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室/国家传染病医学中心
研究背景
结核分枝杆菌（MTB）作为结核病的病原体，其巨噬细胞内“成功”生存，部分归功于它对宿主的动态和恶劣微环境（如低pH、低营养和缺氧等）的感知及反应能力。其中利用环磷酸腺苷（cAMP）作为第二信使来感知和应对各种外部环境就是分枝杆菌应对宿主环境的重要机制之一， cAMP可通过结合并激活cAMP受体蛋白（CRP）来传递信号。 CRP被认为是一个参与MTB代谢、感受NO及毒力等相关至少约100个基因调节的全局调节子，然而以往研究主要集中在CRP蛋白对靶基因转录水平上的调控，分枝杆菌如何调控CRP自身活性并调控下游靶基因的分子基础并不完全清楚。本文研究发现分枝杆菌通过代谢产物AcP调节CRP蛋白193位赖氨酸（K）的乙酰化修饰来调控CRP活性进而影响下游靶基因的转录并调控分枝杆菌毒力的机制。
研究方法
1.体外评价K193位点乙酰化修饰对MTBCRP结合DNA能力的影响
（1）构建并纯化MTBCRPWT ， K193位点突变蛋白（CRPK193Q模拟乙酰化蛋白， CRPK193R模拟非乙酰化蛋白， CRPK193A无侧链蛋白）及定点乙酰化修饰蛋白（CRPK193Ace）；（2）将可结合CRP蛋白的DNA探针进行生物素标记，利用凝胶迁移实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)检测CRPK193位点模拟（去）乙酰化及定点乙酰化修饰对其DNA结合能力的影响。
2.评价分枝杆菌菌体内K193位点（去）乙酰化修饰状态对下游靶基因转录的调控作用、对分枝杆菌生长和应对不利环境能力的影响
（1）为探究乙酰化修饰对菌体内CRP功能的影响，构建了耻垢分枝杆菌（MSM）基因组CRP编码基因K193位点定点突变菌株（Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R）；（2）评价CRPK193（去）乙酰化修饰对其下游靶基因转录水平的影响；（3）评价CRPK193（去）乙酰化修饰对耻垢分枝杆菌生长的影响；（4）探究CRPK193（去）乙酰化修饰对细菌应对不利环境胁迫能力的影响。
3.评价K193位点（去）乙酰化修饰对分枝杆菌胞内生存和毒力影响
（1）评价CRPK193（去）乙酰化修饰不同状态的菌株侵染巨噬细胞和胞内复制能力差异；（2）通过小鼠感染实验评价CRPK193（去）乙酰化修饰不同状态对分枝杆菌毒力的影响。
4.探究CRPK193位点可逆乙酰化修饰的调控机制
（1）构建海分枝杆菌及结核分枝杆菌影响AcP产生的敲除株(Mma-△ackA ， MTB-△ackA)和NAD+依赖去乙酰化酶编码基因敲除株（△Rv1151c）；（2）菌体内、外评价CRPK193乙酰化和去乙酰化的调控机制。
研究结果
1.CRP的K193乙酰化修饰影响其DNA结合能力：相比野生蛋白， CRP蛋白K193位点突变为谷氨酰胺（CRPK193Q ，模拟乙酰化）完全丧失了其结合靶DNA的能力，然而突变为精氨酸（CRPK193R ，模拟非乙酰化）对其结合DNA能力并没有明显的影响（图1a）。同时无侧链丙氨酸突变蛋白（CRPK193A）结合DNA能力不变，提示赖氨酸侧链对于CRP与DNA结合的能力不是必需的，支持K-to-R和K-to-Q突变体之间不同的结合能力是由于K193的类似于不同乙酰化状态的不同电荷导致的。用N?-乙酰赖氨酸体外表达系统制备K193定点乙酰化蛋白（CRPK193Ace）（图1b），进一步确认CRPK193Ace蛋白不能结合靶DNA（图1c），确证了K193乙酰化修饰导致CRP结合靶DNA能力丧失。