经验分享：纳米抗体技术应用的最新进展( 二 )

中国农业大学Liu等[37]用半抗原CBR1与钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)偶联，将CBR1-KLH进行皮下免疫羊驼，然后经提取总RNA、PCR扩增VHH片段、酶切、转化等步骤后成功构建VHH库，构建的文库大小约为1×108CFU/mL ，经过洗脱、淘选、纯化等一系列过程后制备了甲萘威特异性VHHs ，开发了基于Nb的免疫测定方法检测谷物中的广谱氨基甲酸酯类杀虫剂甲萘威(carbaryl) ，且在谷物样品中的可重复性和再现性良好，本课题组参与了其中的部分研究工作，对基于Nb的小分子检测有了一定的研究基础。
Nb在农药兽药残留以及重金属检测中表现出较高的应用价值。 Li等[38]研究发现纳米抗体-碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)对除草剂2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)表现出优异的敏感性和特异性(IC50=29.2ng/mL) ， 2,4-d深埋在CDR3和CDR2形成的袋中， NB3-9的结合袋通过氢键和疏水力与2,4-d的相互作用，在此基础上开发了以纳米抗体-碱性磷酸酶(AP)融合为基础的2,4-d一步荧光酶免疫测定法(one-stepfluorescentenzymeimmunoassay,FLEIA) ，通过分析比较确定了FLEIA法可作为一种监测环境中2,4-d残留的便捷工具。 3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)被广泛用作人类拟除虫菊酯类杀虫剂暴露的常见生物标志物，近期El-Moghazy等[39]研制了一种基于纳米抗体的新型电化学竞争免疫传感器用于3-PBA的快速检测，检测限为0.64pg/mL ，检测限远低于胶体金/单克隆抗体/侧向流动免疫分析方法， LOD为130ng/mL[40] 。
Nb在检测食品和环境真菌毒素方面展现了强大的应用前景。 Wang等[41]开发并优化了PO8-VHH的纳米抗体-多克隆抗体夹心ELISA法测定农产品中的曲霉病菌，能够达到1μg/mL浓度的检测效果，进而监测农产品曲霉污染。 Tang等[42]使用OTA和抗OTANb分别与两种尺寸的高效荧光标签-量子点(quantumdot,QD)共价耦合，制备了OTA标记的GQD结合物(OTA-GQD)和Nb28标记的RQD偶联物(Nb-RQD)分别作为能量供体和受体，如图2所示，开发出一种Nb-FRET(荧光共振能量转移)免疫传感器用于检测谷物样品中赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA) ，易于表达、小尺寸的Nbs可以缩短两个QD之间的有效距离，从而提高检测灵敏度，单步测定可以在5min内完成，检测限为5pg/mL 。

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Nb-FRET免疫传感器
2.2病原体感染诊断工具
纳米抗体在病原菌引起的感染诊断方面的突出表现，可以为疾病的早期诊断提供便捷，帮助我们快速控制疾病的恶化并达到治疗的目的。
牛结核病是一种主要由于感染结核分枝杆菌发病且死亡率极高的慢性人畜共患传染病，研究发现牛结核分枝杆菌表达多个分泌蛋白，其中Ag85B是牛结核分枝杆菌主要的分泌蛋白之一[43] ，本课题组已经成功构建了抗牛结核分枝杆菌VHH抗体库，且以Ag85B蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术经淘选并富集及蛋白芯片互作技术筛选得到抗Ag85B的VHH抗体，为牛结核病的诊断和治疗奠定基础[44] 。
沙门氏菌引发的食物中毒占据食物中毒首列， He等[45]在对免疫骆驼纳米抗体库进行生物淘选后，首次分离出了针对肠炎沙门氏菌的纳米抗体，将C端含有6×His标签标记的3个纳米抗体的质粒亚克隆到大肠杆菌Top10F′中，通过异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside,IPTG)诱导过夜表达，并用Ni-NTA亲和柱进行纯化，最后开发了一种基于Nb13的夹心ELISA法用于牛奶样品中的肠炎沙门氏菌检测，检测限可达1.4×105CFU/mL 。
锥虫病是一种由寄生虫引起的睡眠病。 Pinto等[46]通过质谱选择后鉴定出一对特异性针对锥虫丙酮酸激酶(TcoPYK)的Nb对(Nb44/Nb42) ，并建立了两种异源夹心试验法：侧向流动侧流法(LFAs)和ELISA法用于检测感染小鼠和牛血浆样本中的寄生虫病，测定LOD分别为220ng/mL和14ng/mL ， LFAs展示出了良好的特异性(92%) 。