经验分享：纳米抗体技术应用的最新进展

1993年科学家首次报道了骆驼中存在一种天然缺失轻链、通过重链上的可变区结合抗原的重链抗体(heavychainantibodies,HCAb) ，之后陆续在羊驼、单峰驼和美洲驼等驼科[1] ，以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中同样发现了类似结构的抗体[2] 。人们在重链抗体可变区片段(variabledomainoftheheavychainofheavy-chainantibody,VHH)基础上开发了一种仅由重链可变区构成的单域抗体(singledomainantibody,sdAb) ，长4nm ，直径2.5nm ，分子量为12–15kDa[3] ，是目前已知最小的活性抗原结合蛋白，仅为传统抗体大小的十分之一[4] ，也被称为纳米抗体(nanobody,Nb) ，其独特的结构和优越的特性使其成为多领域的研究热点。骆驼是丝绸之路文化的象征，宁夏回族自治区位于丝绸之路上，骆驼资源丰富且有着得天独厚的自然养殖条件，全国约有骆驼30万峰，主要分布在内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等地区约110万km2的干旱荒漠草原上，本实验室作为西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，立足西部地区牛羊养殖业、马铃薯产业、中药材产业和生物发酵产业等特色资源和优势产业，针对制约产业发展的关键技术问题开展科学研究，现已开展部分研究工作对驼源纳米抗体在小分子化合物检测和病原菌感染方面进行了基础性探究。
1纳米抗体优势
纳米抗体抗原结合区由单个域组成，分子量小，组织渗透性高，可快速、均匀扩散，利于其穿透致密组织发挥作用，为各类疾病提供新的治疗方法[5-6]；Nb的VHH域与传统抗体的重链可变区(variableregionoftheheavychainofconventionalantibodies,VH)域有较高的同源性，同人源抗体VH相比， VHH有较长的互补决定区(complementaritydeterminingregion1,CDR1)和CDR3区，伸长的CDR3环为纳米抗体的多种研究提供了可能，且与传统抗体的VH结构域[7](图1)相比， Nb的框架区(frameworkregion,FR)内维持VH/VL相互作用的疏水氨基酸突变为亲水氨基酸，提高了溶解性和稳定性[8] ，因此通过设计可实现人源化改造；可能由于Nb凸起的对角和灵活的长CDR3环，形成loop环与蛋白质空间构象上的裂隙和空腔结合，从而能识别空腔和隐蔽的凹形表位如酶活性位点和隐匿病毒表位，这意味着Nb有助于预测新的潜在生物靶标及发现新的药理靶点，还可用作酶抑制剂[9]；Nb在恶劣环境如极端温度和pH条件下表现出优异的耐受性，更易于储存和运输[10]；Nb目前已经容易大规模、低成本地在多种系统中表达，具备易筛选和纯化、相对较低的生产成本等优点，在大肠杆菌和酵母或哺乳动物细胞中目前已可高水平表达，且在烟草植物、拟南芥、水稻、大豆等植物表达系统中已成功表达了纳米抗体，此表达系统显示出了独特的优越性[11-12]；此外通过基因工程操作可实现重塑化设计， Nb的可组合性意味着通过寡聚可增加其亲和性或血清半衰期，进而发挥药物在靶器官内的功能，目前除了单价纳米抗体，人们致力于双价VHH、双特异性VHH、多价VHH以及融合VHH的研究，来增强其对目标的特异性以及功能性等特性，即有利于药物发挥其高效作用[13] 。纳米抗体具有分子小、水溶性好、亲和性和稳定性高、特异性强、易于表达生产且能进一步修饰等优点，在多个领域内都有极大的应用前景(表1) 。

文章图片
VH、VHH结构示意图[7]Fig.1Schematicdiagramo
2检测、诊断和治疗
2.1小分子化合物检测
纳米抗体在环境污染物、生物毒素等小分子化合物的检测中不仅降低了检测下限，提高了灵敏度和精确度，而且通过优化测定过程，能够实现快速简便的检测，推动免疫检测方法和传感技术的快速发展， Nb在竞争性ELISA法、免疫PCR、荧光偏振免疫分析和横流免疫分析等免疫检测技术的研发中取得了令人满意的成果[36] 。