检测蛋白质的方法有哪些 检测蛋白质的一般方法


检测蛋白质的方法有哪些 检测蛋白质的一般方法

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1、凯氏定氮法
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法 。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收,再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量 。
由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法 。
2、双缩脲法
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法 。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液,呈蓝色,由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制 。
当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,配合物呈紫色 。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm 。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml 。鉴定反应蛋白质单位1-10mg 。
3、酚试剂法
取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值 。
4、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液 。
取9支试管分别标号,前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,1号试管不加标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,而不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在280nm波长处进行比色,记录吸光度值 。
5、考马斯亮蓝法
【检测蛋白质的方法有哪些 检测蛋白质的一般方法】考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合 。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后,其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm 。
在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下,当溶液中的蛋白质浓度不同时,就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式,而且这种转变有一定的数量关系 。
一般情况,当溶液中的蛋白质浓度增加时,显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加,因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量 。