《自然·癌症》：第四代EGFR TKI临床开发迈出关键一步( 二 )

研究人员构建了均含有EGFRL858R/T790M突变的H1975细胞（人肺腺癌细胞）和患者来源的DFCI52细胞异种移植肿瘤模型，以评估JBJ-09-063在体内的作用。
在H1975模型中， JBJ-09-063可使肿瘤体积呈剂量依赖性缩小，并且比JBJ-04-125-02更有效。值得注意的是， 50mg/kg和100mg/kg剂量的JBJ-09-063与25mg/kg奥希替尼的治疗效果相当。在DFCI52模型中， 50mg/kg剂量的JBJ-09-063与奥希替尼的治疗效果相当。

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JBJ-09-063在体内对EGFRL858R/T790M突变肿瘤具有良好的治疗作用
同样的，在DFCI52-C797S和H3255GR-C797S细胞构建的异种移植肿瘤模型（对奥希替尼耐药）中， JBJ-09-063同样具有显著的治疗作用。

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JBJ-09-063在体内对EGFRC797S突变肿瘤具有良好的治疗作用
但出人意料的是，体外的DFCI52细胞和H3255GR细胞（细胞具有EGFRT790M突变，对吉非替尼耐药）对JBJ-09-063并不如在体内时那么敏感，而当ATP竞争性EGFR抑制剂吉非替尼与JBJ-09-063联用后，可显著抑制DFCI52细胞和H3255GR细胞的生长。

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体外的DFCI52细胞对JBJ-09-063耐药，但和吉非替尼联用后可显著抑制细胞生长
同样，在体内对JBJ-09-063敏感的H3255GR-C797S和DFCI52-C797S（细胞具有EGFRC797S突变，对奥希替尼耐药）细胞，在体外也对JBJ-09-063耐药， JBJ-09-063和奥希替尼联用可逆转这一耐药性。
研究人员猜想，这些细胞在体外培养时，必然因某些原因使得EGFR构象改变，使得原本对JBJ-09-063敏感的细胞变得耐药，而EGFRTKI可以逆转这一耐药性。
经过研究，研究人员发现原来是由于培养基中的ERBB家族配体（如EGF和NRG1）与EGFR结合，导致EGFR与自身或其他ERBB家族成员二聚化，使得JBJ-09-063无法抑制EGFR的磷酸化，从而出现了耐药性。而EGFR-TKI与EGFR的结合抑制了二聚体的形成，从而恢复了细胞对JBJ-09-063的敏感性。
对奥希替尼耐药的除了常见的C797S之外，还有一些突变也可导致对奥希替尼耐药，包括L718Q突变、L792F突变和G796S突变[7] ，这些突变局限于ATP位点，影响奥希替尼与位点的结合，但理论上不会影响与变构抑制剂的结合。

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C797S突变、L718Q突变、L792F突变和G796S突变影响奥希替尼与位点的结合，但理论上不会影响与变构抑制剂的结合
为了验证JBJ-09-063在这些突变的情况下是否有效，研究人员构建了EGFRLT/L718Q、EGFRLT/L792F和EGFRLT/G796S的BA/F3细胞，并比较了JBJ-09-063和奥希替尼对细胞生长和EGFR的影响。实验结果证实这些突变体细胞确实对奥希替尼耐药，但对JBJ-09-063的敏感性都更高， JBJ-09-063能使这些细胞中EGFR磷酸化水平降低，从而抑制EGFR信号转导和细胞生长。这些实验表明， JBJ-09-063可广泛有效地治疗对奥希替尼耐药的EGFR突变肿瘤。
尽管JBJ-09-063对导致奥希替尼耐药的EGFR突变有效，但很可能存在EGFR突变可介导对JBJ-09-063的耐药性。
为了鉴定JBJ-09-063耐药突变，研究人员用1μMJBJ-09-063、1μM奥希替尼或两者联合处理BA/F3细胞来筛选耐药细胞系（每种用法处理900个细胞克隆）。在JBJ-09-063和奥希替尼处理的细胞克隆中，分别有76个和13个细胞克隆生长，当两种药物一起处理细胞时，没有任何细胞克隆生长。

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筛选对JBJ-09-063耐药细胞系
通过对76个JBJ09-063耐药细胞克隆的EGFR酪氨酸激酶（TK）结构域进行测序发现，在76个JBJ09-063耐药克隆中， 3个（3.94%）含有L747S突变，其他73个JBJ-09-063耐药克隆中没有发现任何EGFRTK区突变。