【文献解读】源井CRISPR-B技术助力解密沙门氏菌与Fe的爱恨情仇( 二 ) _健康小知识

为进一步研究Fur被UMP化后的功能，作者分析了UMP化的H33和H118位点的空间结构， H33位于Fe结合位点附近， H118位于Fur同源二聚体的表面。通过序列比对发现， UMP化的残基（H33和H118）在Fur的直系同源物中高度保守，表明YdiU介导的UMP化对Fur的调节被广泛采用。通过建立H118A突变体（由广州源井生物构建），发现Fur不能被YdiUUMP化，从而证明H118是Fur的主要UMP化位点。为了进一步研究UMP化对Fur特性的影响，作者使用体积排除色谱法分析了YdiU敲除的Fur（FurdYdiU）和YdiU表达的Fur（FurpYdiU），两者不同的洗脱峰说明YdiU介导UMP化后， Fur的聚集状态发生了改变。随后用天然凝胶法和动态光散射法（DLS），对沙门氏菌内源Fur与体外UMP化的Fur（FurUMP）进行了比较，与内源Fur相比， FurUMP的条带发生了偏移。总体结果表明Fur经过UMP化后，稳定性更低且更易聚集。随后又通过凝胶迁移实验（EMSA）验证了YdiU通过使FurUMP化影响Fur的DNA结合活性。
最终根据研究结果，作者提出了以下机械模型（图3）：当沙门氏菌在富铁环境中生长时， Fur蛋白与铁摄取基因的启动子区结合，抑制RNA聚合酶的招募并减少铁的吸收；当沙门氏菌进入宿主细胞时，缺铁、高活性氧和低pH均会激活YdiU蛋白的表达；然后YdiU通过UTP将一个UMP基团转移到Fur的H118位点，防止Fur的二聚化；Fur从铁摄取基因的启动子区被取代；通过这种机制，沙门氏菌获得足够的铁在宿主细胞内生存。鉴定的修饰位点在同源蛋白中高度保守，表明Fur的这种调控机制普遍存在。 UMP到组氨酸的共价连接模式与磷酸化组氨酸（pHis）的共价连接模式相似，这在原核信号转导中起关键作用。

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图3沙门氏菌感染过程中YdiU介导的铁摄取调节模型
【【文献解读】源井CRISPR-B技术助力解密沙门氏菌与Fe的爱恨情仇】UBIGENE在该研究中利用了独家CRISPR-B?技术构建了沙门氏菌的H118A突变体，有效验证了铁稳态主要调节剂fur的主要UMP化位点。 CRISPR-B?技术是源井基于Red/ET重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过优化基因编辑载体和基因编辑流程，在基因编辑效率和准确性均远高于传统方法的一项创新性技术。该技术可实现大肠杆菌/沙门氏菌/铜绿假单胞菌的无痕基因编辑，且应用范围广泛，包括基因敲除，基因点突变和基因敲入；返回搜狐，查看更多
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