肝素|MP 淋巴细胞分离液使用说明书血液|淋巴细胞|离心管|说明书

LSM 淋巴细胞分离液
用途：
用于体外分离外周淋巴血细胞
方法概述：分离混合血液白细胞早期的方法，总是伴随红细胞聚集，只轻微影响白细胞。通过离心，红细胞密度增加聚集，同时可以从离心管上部收集白细胞。
B?yum提出了一种更方便，通过使用Ficoll? 甲泛影钠溶液离心快速分离方法。稀释的血液在Ficoll?甲泛影钠溶液中分层，低速短时离心。红细胞和沉降到管底的粒细胞，和单个核细胞（淋巴细胞）和血小板可以从两个分层之间收集。
许多研究者不断努力，修订了B?yum方法， MP生物医学公司生产的LSM ，方法的独特之处是运用,泛影钠成功的代替了甲泛影钠。
程序原理：除去血液中的纤维蛋白或肝素处理血液以1：1的比例用生理盐水或平衡盐溶液稀释，在分离溶液中分层，低速离心30分钟。通过离心，迁移能力不同最终形成不同的细胞层。
大部分的红细胞和粒细胞通过梯度迁移形成颗粒状。由于其密度不同，淋巴细胞和其他单个核细胞（单核细胞和血小板）分布在在血浆和LSM两层中间。淋巴细胞可以通过回抽分层回收，在进一步去除血小板， LSM和血浆。
试剂： LSM? is a sterile filtered solution which contains 6.2g Ficoll and 9.4 g sodium diatrizoate per 100 ml. The density is 1.0770-1.0800 g/ml at 200C.
LSM? 是一种灭菌过滤溶液，每100毫升包含6.2克聚蔗糖和9.4克钠胺。密度是1.0770-1.0800克/毫升20℃ 。
使用说明：以下的操作步骤是最初由B?yum.设计的程序的众多改良版本中的一种。此程序的改良是通过运用除去血液中的纤维蛋白或抗凝血剂处理人体血液；这种改良对于其他物种来源血液或者其他组织非常有必要。
1. 轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合

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2. 无菌转移3 mlLSM到15 ml离心管中。
3. 混合2 ml除纤维蛋白血液或肝素处理血液和2 ml 生理盐水
4. 仔细的将稀释血液加入3 mlLSM（室温）于15ml离心管中，在血液和LSM中形成一个明显的分层。不要将稀释血液混合入LSM中。
5. 室温下400g离心15-30分钟，离心可以沉淀红细胞和多核白细胞同时可以再LSM上形成一层单核淋巴细胞，如上图所示。
6. 吸出淋巴细胞上方2-3mm的血浆。
【肝素|MP 淋巴细胞分离液使用说明书】7. 吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM和转移到另外的一个离心管。加入等体积的平衡盐缓冲液至淋巴细胞离心管中，室温离心10分钟，离心速度设定在既不损伤细胞又能沉淀细胞即刻，例如160 - 260 x g（去除LSM和降低血小板的百分比）。
8. 用平衡盐缓冲液清洗细胞，用适当的培养基重悬细胞。
实验步骤
1. 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液或PBS按照1：1 稀释；
2.在15ml或50ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：稀释后血液=1:1；
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面；
4.室温 2600rpm 离心20分钟；
5. 取出离心管，小心吸出白白的那一层，重悬于5倍体积的不完全培养液或PBS中，混匀；
6.室温 1500rpm 离心5分钟；
7.吸弃上清，再加4ml不完全培养液，混匀；
8.室温 1000rpm离心5分钟；
9.弃上清，用完全培养液稀释至2ml；
10.淋巴细胞记数；
11.按所需浓度及实验目的稀释细胞，种板。
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分离外周血中的单个核细胞