异氟醚通过激活PERK/eIF2α通路诱导神经元凋亡和ERS在PND中的作用机制

作者：古麻今醉
董营1何二涛2师荣荣1
1定州市人民医院麻醉科，定州073000；2兰州大学第二医院麻醉科，兰州730000
国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(08):789-794.
DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20211116?00603
基金项目
河北省医学科学研究重点课题计划（20181474）
ORIGINALARTICLES
【论著】
本研究主要分析内质网应激（ERS）在围手术期神经认知障碍（PND）中的作用并探讨通过蛋白激酶样内质网激酶（PERK）抑制剂GSK2606414阻断ERS对老年PND大鼠模型神经功能的影响。
1资料与方法
1.1分组、建模和干预方法
30只健康雄性SD大鼠，按随机数字表法分为3组（每组10只）：对照组、异氟醚组和PERK抑制剂组（GSK组）。异氟醚组和GSK组根据参考文献建立PND模型，方法如下：将大鼠禁食、禁饮8h后放置在60cm×30cm×25cm的透明麻醉箱内，麻醉箱的一侧通道连接麻醉机，另一侧通道连接气体监测仪；调节异氟醚浓度至2% ，氧流量3L/min ，连续4h 。对照组进行同样的处理但不吸入异氟醚。 GSK组根据参考文献，在吸入异氟醚6h前（麻醉前）使用PERK抑制剂GSK2606414进行灌胃（150mg/kg），对照组给予等量生理盐水灌胃。
1.2水迷宫实验检测神经功能
所有大鼠吸入异氟醚4h后进行水迷宫实验。通过检测大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间评估大鼠神经功能（逃避潜伏期越长、穿越平台次数越低、目标象限停留时间越短提示神经功能损伤越严重）。
1.3TUNEL染色检测海马组织神经元细胞凋亡率
水迷宫实验结束后，腹腔注射戊巴比妥（2ml/kg ，浓度20g/L）麻醉处死所有大鼠。每组选取3只取海马组织。每个样本随机选择5个于荧光显微镜下观察（×100），细胞核染色为蓝色荧光，呈黄绿色荧光的细胞记为凋亡细胞，细胞凋亡率=（凋亡细胞/总细胞数）×100% 。
1.4Westernblot法检测海马组织真核翻译起始因子2α（eIF2α）、PERK磷酸化水平及78kDa葡糖调节蛋白（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）水平
每组另取4只大鼠取海马组织。液氮下研磨海马组织，并用预冷的PBS洗涤。然后将样品在冰冷的RIPA裂解缓冲液中裂解，采用BCA试剂盒测定总蛋白含量。后将蛋白样本与角质酶Ⅱ混合并进行电泳。用10％凝胶通过SDS?PAGE分离等量的总蛋白（120V下电泳90min），然后转移到PVDF膜上（50V ， 120min），在含有5％脱脂牛奶的封闭溶液中封闭。然后将PDVF膜与一抗（1∶1000稀释）在4℃孵育过夜，加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶耦联二抗在室温下孵育1h 。使用ECL试剂盒可视化蛋白条带，使用甘油醛?3?磷酸脱氢酶作为内参对蛋白条带的灰度进行定量。以磷酸化PERK（p?PERK）/PERK、磷酸化eIF2α（p?eIF2α）/eIF2α表示PERK、eIF2α磷酸化水平。
1.5免疫组化染色检测海马组织B淋巴细胞瘤?2（Bcl?2）及B淋巴细胞瘤?2?AssociatedX（Bax）水平
每组剩余3只大鼠取海马组织。将固定的大鼠海马组织样本切成4μm的石蜡切片，脱蜡后3％H2O2处理10min 。洗涤后用0.01mol/L的柠檬酸缓冲液（pH6.0）进行热介导的抗原修复。然后使用PBS洗涤2次加入10％山羊血清封闭30min ，后与兔抗大鼠Bax抗体（1∶1000稀释）、Bcl?2抗体（1∶1000稀释）在4°C下过夜。与山羊二抗一起孵育后，在室温下放置2h 。 DAB染色后使用苏木精复染，检测各组的光密度（D）反映染色强度（反映海马组织Bax、Bcl?2水平）。
2结果
2.1各组大鼠水迷宫实验结果比较
异氟醚组逃避潜伏期长于GSK组及对照组（P<0.05），穿越平台次数、目标象限停留时间少于GSK组及对照组（P<0.05）。见表1 。