经验分享：悬浮细胞中生产 AAV 载体细胞培养工艺开发简介( 二 )

种群倍增时间(PDT)平均约为20小时，图4.在10次传代中保持了良好的细胞活力(>97%) 。

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图4.(A)在10次传代中HyCell?TransFx-H培养基中生长的细胞的群体倍增时间。 (B)10次传代中的细胞活力。
利用质粒构建体进行AAV工艺开发
质粒构建体包含生产AAV所需基因和DNA序列，并在我们的工艺开发中采用，最初由NordicBiosite提供。
【经验分享：悬浮细胞中生产 AAV 载体细胞培养工艺开发简介】AAV生产中的质粒扩增通过使用质粒转化细菌来实现。随后在培养转化细菌时复制质粒DNA 。通过使用质粒纯化试剂盒，可以从收获的材料中回收大量的质粒DNA 。
实验设计(DoE)；使用HEK293T悬浮细胞优化的rAAV生产方案
进行了一系列实验设计(DoE)研究以评估转染的最佳条件。总共开展了五项研究，其中四项是针对rAAV2的。在我们的工艺开发过程中，目标是达到以下条件以满足下游工艺的要求：1014个病毒颗粒(VP)/L ， 1013个病毒基因组(VG)/L ，以及收获材料中完整衣壳的百分比为10%及以上。实验设计(DoE)研究1–4表明我们无法满足rAAV2的所有要求，因此，对开发的转染方案进行了rAAV5测试。因此DoE5设计为一项验证研究，用于确认rAAV5生产的最佳DNA浓度和DNA-PEI复合物孵育时间。
DoE1
DoE1研究了质粒DNA浓度、不同细胞密度、PEI/DNA比率、转染体积和孵育时间（表1）。为了验证不同条件的影响，对转染效率进行了研究。
表1DoE1设置中使用的参数

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在瞬时转染中， PEI将质粒DNA浓缩成带正电荷的颗粒，与阴离子细胞表面相互作用， PEI/DNA复合物通过内吞作用进入细胞。 PEI/DNA的比例对转染效率起到关键作用。我们使用MODDE?Prov12.0.1软件(SartoriusStedimGmbH)评估了DoE1中的所有参数，该软件汇总并评估了所有数据。我们通过评估结果就能够预测出应该使用哪些参数来实现高转染效率（图5）。

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图5.要在转染后72小时后实现最佳转染效率， (A)转染体积需要为总体积的6% 。 (B)增加转染孵育时间会对转染效率产生不利影响。
DoE2
根据DoE1的评估结果对第二部分(DoE2)的以下参数进行了设置。在DoE2中研究和评估了温度和DNA质粒比率。
DNA的最佳数量取决于转染质粒的特性（例如，质粒的大小、复制来源）。各种基因的份额也会影响产量，并对pAAV-RC2载体(a)、pHelper载体(b)和pAAV-GFP载体(c)进行了不同比例的测试。我们还评估了rAAV生产过程中不同温度下对转染效率的影响—温度分别为34°C、35.5°C和37°C 。
DoE1和DoE2之间的差异在图6中用圆圈标记。

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图6.与用圆圈标记的DoE1的参数相比， DoE2中评估的参数与HEK293T细胞（GFP表达细胞的百分比）的转染效率提高相关。
AAV感染性和随后的GFP表达由转导测定确定。通过转导分析对裂解的样品进行定量，并通过流式细胞仪进行评估，由转导细胞表达GFP阳性细胞，并且使用结果计算感染滴度(TU/mL) 。这表明DNA比率差异与提高感染滴度有关。
DoE2中基于转导测定的各种参数如图7所示。圆圈表示DoE2相较于DoE1的改进之处。

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图7.在DoE2中评估的有助于提高HEK293T细胞感染滴度的参数。 DoE1中的条件被圈出，
DoE3
qPCR可以帮助我们分析病毒基因组滴度。这对于进一步优化工艺和增加收获材料中完整衣壳的份额非常重要。通过比较qPCR的VG滴度数据(VG/L)与ELISA检测到的衣壳蛋白数量（衣壳/mL），可以估计完整衣壳的百分比。很明显，转染效率与病毒滴度（通过ELISA和qPCR测量）的相关性较差。