sgRNA|在iPS中利用CRISPRi系统发现病毒感染新机制——NEPA21高效基因转染系统助力结果|细胞|系统|基因|研究|抑制

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是一种严重的急性呼吸道传染性疾病，其由急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV-2感染所致。自COVID-19新冠肺炎疫情爆发至今，已两年有余。除了疫苗接种，目前医学界还没有针对治疗新冠的特效药问世。而关于其感染机制的研究，对于新冠药物的研发至关重要。
据报导，SARS-CoV-2 的感染需要许多受体和蛋白酶。在感染期间，SARS-CoV-2 刺突（ S ）蛋白与细胞表面表达的血管紧张素转换酶 2 （ ACE2 ）结合，并被跨膜蛋白酶丝氨酸 2 （ TMPRSS2 ）等蛋白酶切割，导致 S 蛋白分裂为 S1 和 S2 结构域。SARS-CoV-2 通过 S2 结构域融合和侵入细胞。因此，SARS-CoV-2 感染被认为是依赖于宿主细胞中 ACE2 和 TMPRSS2 的表达。然而，除了 ACE2 和 TMPRSS2 之外的其他蛋白分子也在 SARS-CoV-2 感染中起着重要作用。
近期，有研究学者通过通过CRISPR/Cas9基因编辑系统和表达ACE2的人类诱导多能干细胞（iPS）检测了神经纤毛蛋白 -1 （ NRP1 ）、碱性蛋白 BSG 、跨膜丝氨酸蛋白酶（ TMPRSS ）和组织蛋白酶（ CTS ）在 SARS-CoV-2 感染中的作用。该研究发现双重敲降 TMPRSS2 和组织蛋白酶 B （ CTSB ）可将病毒载量降低至 0.036%±0.021%。CTPB 抑制剂 CA-074 甲酯和 TMPRSS2 抑制剂C amostat 的组合更将病毒载量降低至 0.0078%±0.0057%。这些研究结果都在四种 SARS-CoV-2 的变异株（β .1.3 、β .1.1.7 、β .1.351 和β .1.1.248 ）中得到证实。同时使用这两种药物都可将人类男性和女性 iPS 中的病毒载量降低到 0.01% 以下。这些发现表明，对于 TMPRSS2 和 CTSB 的靶向化合物表现出高效的抗病毒效果，这可以为 COVID-19 的治疗药物研发提供一种思路。
为了阐明除ACE2以外的受体和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能，该研究通过使用过表达ACE2的iPS（ACE2 iPS）和CRISPRi系统抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表达水平，并设计了针对这些基因的sgRNA 。用表达sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的质粒电转染iPS ，如下图所示。

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在比较通过 dCas9 蛋白表达抑制 ACE2 的 iPS 中目标基因的表达水平后，对细胞进行 SARS-CoV-2 感染，如下图所示。

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结果发现CTSL、CTSB和TMPRSS2的抑制使得ACE2 iPS中的病毒RNA拷贝数分别降低至11.7%±3.77%、0.84%±0.062%和20.6%±10.4% 。 TMRPSS2的抑制始终减少了刺突（S）蛋白的ACE2 iPS的数量。这些结果表明， CTSB、CTSL和TMPRSS2参与了ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染。
基于上述发现，该研究团队接下来探究了CTSB、CTSL和TMPRSS2抑制剂是否能抑制ACE2 iPS中的SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2感染表达ACE2的iPS后，细胞在CA-074甲酯（CA-074 Me ， CTSB抑制剂）、Z-Phe-Tyr（tBu）-重氮乙基酮（CTSL抑制剂）、卡莫司他（TMPRSS2抑制剂）或纳法莫司他（TMPRSS2抑制剂）的存在下培养，如下图所示。

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结果发现在表达 ACE2 的 WTB CRISPRi Gen1 细胞中，经 CA-074 Me 处理后，病毒 RNA 的拷贝数减少至 0.62%±0.25%。在表达 ACE2 的 1383D6 细胞中，通过 Camostat 和 Nafamostat 处理，病毒 RNA 拷贝数分别减少至 0.48%±0.023% 和 0.23%±0.14%。在这四种化合物中，Nafamostat 对 ACE2 iPS 具有细胞毒性。这些结果表明，CA-074 Me 或 Camostat 治疗可降低 ACE2 iPS 中 SARS-CoV-2 的感染效率。