慢性乙型肝炎病毒患者肝内原位病毒学分析

乙肝病毒是一种严重影响人类健康的病原体，也是引发慢性乙肝的元凶。根据国际卫生组织2015年估计，全球约有2.4亿慢性乙肝患者，大多分布在低收入及中等收入国家，每年约有78万患者死于慢性乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和癌。在中国，约有9300万慢性乙肝感染者，其中，由乙肝病毒引发的肝硬化和肝癌患者比例分别高达60%和80% 。随着乙肝疫苗接种的推行，我国婴幼儿的乙肝阳性率有了大幅度的降低。但是，对于其他感染者，依然缺乏彻底治愈的疗法，并且给患者家庭带来了沉重的经济负担和健康威胁。
大量临床与基础研究表明，慢性乙肝长期迁延不愈的根本原因在于乙肝病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)在肝脏内的长期存在及其造成的病毒表面抗原血症。由于cccDNA在慢性乙肝患者肝脏中的水平极低，传统的分子生物学方法（如Southern印记、cccDNA特异性聚合酶链反应）不仅检测困难，而且无法显示其在组织内的分布特点。
鉴于目前对乙肝cccDNA研究存在的问题，来自复旦大学上海医学院医学分子病毒学重点实验室的Zhangxiaonan等研究者在bDNA信号扩增技术基础上进行二次开发，成功建立了一种能够在组织水平显示cccDNA分布的原位杂交技术。该技术还能显示乙肝病毒的其他复制中间体，如前基因组RNA(pgRNA)、松弛环状DNA(rcDNA)在单细胞水平的分布情况。研究者将该原位杂交技术与乙肝病毒主要抗原的免疫组化染色相结合，获得了病毒核酸与蛋白同时存在的图像。令人意外的是，乙肝病毒抗原与核酸在单细胞水平呈现惊人的“马赛克状”分布，即病毒的cccDNA、RNA与表面抗原均显示显著的负相关关系。本研究还进一步证实，经过一年以上抗病毒治疗的患者的肝细胞内仍存在乙肝病毒的cccDNA 。综合前期研究，本研究基于大量患者样本的观察结果，提出在单细胞水平乙肝病毒存在“抗原富集期”、“DNA富集期”和“潜伏期”的“三阶段”假说，推测患者体内肝细胞生理水平和病毒复制活跃度的变化可以导致这三个阶段的相互转换。该假说从单细胞水平描述了病毒生活周期的复杂变化模式，丰富了学术界对乙肝病毒在肝内存活的认识，为进一步针对不同病情患者清除乙肝病毒cccDNA的新策略提供了理论基础。
主要实验结果如下：

文章图片
Figure1.Validationofthespecificityofthestrand-specificprobesetsdesign.TissuesectionsfromCHBpatientswerepretreatedwiththeindicatednucleaseandhybridizedwiththedesignatedprobesets:(A–C)probeset1(originalmagnification,×200;insets,×400);(D–F)probeset2(originalmagnification,×200;insets,×400);(G–I)probeset3(originalmagnification,×400;insets,×600).Afterhybridizationandsignalamplification,NBT/BCIPwasusedforcolorization,followedbycounterstainingwithnuclearfastred.

文章图片
Figure2.SubcellularlocalizationofHBVDNAsignalishighlyrelatedtoitsreplicationstatus.Representativecytoplasmic(A)andnuclear(B)stainingpatternofHBVDNA.(C)SerumHBVDNAlevelsfromcytoplasmic-(n=26)andnuclear-localized(n=21)groupswerecompared.ThePvaluewasdeterminedbyaMann-WhitneyUtest.(D)Comparisonofthepercentageofcytoplasmic-andnuclear-localizedsamplesfromHBeAg-positiveand-negativepatients.

文章图片

文章图片
Figure3.Spatialrelationshipbetweenintrahepaticviralnucleicacids(HBVDNA,RNA,andcccDNA)andsurfaceantigen.Probeset2or3washybridizedwithHBVDNA(AandC)orcccDNA(BandD),inconjunctionwithHBsAgIHCusingadjacentsectionsfromthesameliverspecimen.ImagesinCandDarehighermagnificationsoftheboxedareasinAandB,respectively,whichshowsimilarregionsinadjacentslices.HBVRNAwasvisualizedwitheitherprobeset1(E)orprobeset3(F)inthecontextofHBsAgexpressionusingadjacentsectionsfromthesameliverspecimen.Blue-purple,DNA,cccDNA,orRNA;brown,HBsAg.Originalmagnification,×100(AandB),×400(CandD),×600(CandDinsets),×200(EandF),×400(EandFinsets).