一双“慧眼”看穿冻卵活性，拉曼光谱的确“靠谱”( 二 )

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图1研究成果（图源：[1]）
此研究以卵母细胞作为研究对象，使用甘油/丙二醇（Propyleneglycol ， PG）作为冷冻保护剂，依据标准冷冻方案对卵母细胞进行冷冻保存。具体地，该冷冻方案步骤包含四个阶段：（i）以1℃/min的冷却速率从室温冷却至-7℃；（ii）用冷铜线碰触样品以形成冰核；（iii）在-7℃下保持10分钟；（iv）以0.3℃/min的速度进一步冷却至-25℃ 。在大多数卵母细胞和胚胎的冷冻程序中在-7℃下保持10分钟以形成冰核，冰核形成是冰结晶所必需阶段，冷却程序在特定温度下暂停以进行拉曼检测。
拉曼采集平台采用固体激光器（激光波长为532.1nm）， 100×物镜（NA=0.75），横向分辨率~0.6μm ，纵向分辨率~10μm ，光谱分辨率为2.5cm-1；以扫描模式测量了一组拉曼光谱，并在指定坐标处探测了拉曼散射；光谱检测范围为1000至3200cm-1 ，曝光时间3s；在单个拉曼成像实验中测量约2500条光谱。初步数据处理包括测量光谱中高能离子宇宙线去除、基线校正等。进一步的多变量分析包括用于奇异值分解，以及使用交替最小二乘算法对拉曼光谱进行非负矩阵分解等数据处理方法。
研究结果发现：
1、不同温度下脂滴的拉曼光谱特征具有一定规律性
如图2所示，在不同的冷冻温度下收集卵母细胞的拉曼光谱，并分析对脂质相变敏感的aCH2键在拉曼频移2882cm-1处的特征表达，其峰值用来表达不同温度下的脂质相态；通过在~2850cm-1处具有强烈拉伸对称CH2(sCH2)峰，可以在拉曼图中识别出富含脂质的物质。经过统计，在不同温度下脂滴的光谱特征具有一定规律，不同温度时光谱峰值均数：n=1666@-25℃；n＝1214@-15℃；n＝636@-3℃；n=478@+5℃；n=638@+15℃；在-3℃及以下测量的拉曼光谱（图2b）表明拉伸反对称CH2(aCH2)峰对LPT敏感。以上统计的数据表明， LPT开始发生的温度是在+5和-3℃之间。

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图2卵母细胞在不同温度下拉曼光谱的平均光谱（图源：[1]）
注：（a）不同温度下（-25℃~+15℃），卵母细胞中脂滴对应的平均拉曼光谱；CH谱带的拉曼特征区域；（b）表示键在2882处的特征峰。虚线是统计基线。
低温下卵母细胞以及胚胎中， aCH2峰的强度大约是sCH2峰强度的0.7倍。该峰的强度低可能有两种不同的情况导致，第一种可能的情况是所有脂质分子都处于大致相同的构相状态，随着温度的降低逐渐变为更有序的构相状态，这种情况对应于均匀的扩散相变；第二种情况涉及脂质分子以有序和无序的相态共存，在这种情况下，处于无序相态的脂质比例会随着温度升高而降低。
2、拉曼光谱用于检测冷冻卵细胞中脂质相分布不均匀性
为了证实LD中是否存在脂质相态共存，研究人员使用PG作为冷冻保护剂，在T=-25℃条件下处理10分钟后进行两个拉曼成像实验：第一个实验是在-25℃下初步暴露两小时后使用甘油作为冷冻保护剂进行的；第二个实验用于揭示在其他条件下是否会观察到相态共存效应。
研究人员使用NMF-ALS方法构建拉曼谱图，在三个光谱分量的线性组合上分解所有拉曼光谱：这些光谱分量对应于有序相态脂质（SOL）、无序相态脂质（SDL）和细胞质（SC）的贡献。对应的SOL在2882сm-1处有一个CH2峰， sCH模式下的拉曼位移置为2845cm-1；SDL无aCH2的显著峰， 2849сm-1处有CH2峰；SC为冷冻保护剂（甘油或PG ，取决于实验条件）和细胞质蛋白的水性混合物。
图3显示了在-25℃甘油溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（3a）和拉曼成像图（3b）。明场显微镜观察仍然无法判断脂质空间分布的不均匀性（图3a），但拉曼成像图谱可以看出不同相态的脂质在微米尺度上分布不均匀（图3b）。根据图3c中脂质光谱1和2的比较， aCH2拉曼峰（IaCH）的信噪比估值大于10 。因此，拉曼光谱1和2之间的IaCH差异是显著的。