一双“慧眼”看穿冻卵活性，拉曼光谱的确“靠谱”

导语：脂滴在哺乳动物胚胎和卵母细胞的冷冻保存中起着重要作用，但是低温对胞内脂滴的影响以及细胞冷冻损伤的相关机制仍不清楚。近期，俄罗斯研究团队利用拉曼光谱技术揭示了细胞中脂质相变不均匀性，证实了拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面具有可行性。
在卵细胞冷冻保存过程中，除了与水冻结和冷冻保护剂毒性相关的损伤外，还会发生与细胞结构材料特性的低温变化相关的损伤。细胞的脂质结构，如膜和脂滴易受到低温损伤。在生理温度下，大多数生物相关脂质处于液态无序相状态。当冷却至低温时，脂质转变为固体状有序相。相变改变了脂质结构的材料特性，包括刚性和扩散速率。因此，这种转变可能会影响不同细胞器中与脂质相关的生物过程。
当拉曼光谱遇上冻融细胞脂滴：
原位无标记捕捉脂质相变
细胞膜由具有不同熔点的磷脂混合物组成。细胞膜的现代模型是基于具有不同脂质组成的脂质结构的假设，有序相态的高熔点脂质结构被形象的称之为“筏” 。不同相态的脂质共存平衡在细胞功能调节中起重要作用。温度降低会改变不同脂质相间的平衡，从而破坏膜功能。膜特性的变化可能是由于温度变化，除此之外也可能是由于水溶质效应和形成冰晶的影响，因此膜中的脂质相变（Lipidphasetransition ， LPT）会影响冷冻保存后的细胞活性。
脂滴（Lipiddroplets ， LDs）是富含脂质的细胞器，在脂质代谢、细胞信号传导和调节中发挥重要作用。 LDs的低温变化会影响哺乳动物卵母细胞冷冻保存后的活性。一项实验证明猪胚胎细胞中LDs在耐低温特性研究中的作用明显，即预先进行机械脱水的细胞冷冻保存后在体外继续发育的存活率从0%提高到50%以上。与磷脂膜类似， LD在细胞冷冻过程中会发生LPT 。通过与细胞膜进行类比，可以假设细胞质内LDs不是在特定温度的单一熔点下发生LPT ，而是向不同熔点的脂质逐渐扩散转变。细胞内LD中的LPT可能会干扰细胞功能，但与LD相关的低温损伤的特定机制仍不清楚，至少到目前为止，尚无明确关于细胞膜和LD在冷冻细胞中脂质空间分离的直接证据。
红外光谱技术是研究生物细胞中脂质相态的最常用的实验方法，拉曼光谱则是另一种探测脂质相态的方法。与红外光谱相比，拉曼散射光谱可在微观尺度上研究冷冻样品，并以非接触、无标记方式进行测量。此外，拉曼技术可抗水分子物质峰的干扰。此前对卵母细胞以及胚胎中单个LD的拉曼研究表明，与甘油三酯和磷脂系统模型相比，拉曼光谱有相对较高的精度检测LPT的开始与扩散。通过相干反斯托克斯拉曼散射研究揭示白色脂肪细胞中大LD在富含脂肪酸的培养基中培养时会发生脂质相态间的分离，这种现象间接表明不同脂质在不同的温度下会发生LPT 。
Cryobiology：拉曼光谱技术用于
研究细胞冻融后活性是可行的
2020年8月，俄罗斯科学院自动化和电学研究所团队在Cryobiology发表题为“Ramanspectroscopyevidenceoflipidseparationindomesticcatoocytesduringfreezing”的研究成果（图1）[1] 。研究结果表明在?25°C环境下，脂质在脂滴内会以两种分离的相态共存，且在检测空间区域几微米中具有特定的空间分布，其中的高熔点脂质会分布在脂滴表面附近，而低熔/易熔的脂质分布于内部深处。拉曼光谱技术可揭示细胞中脂质相变不均匀性，证实拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面具有可行性。