一双“慧眼”看穿冻卵活性，拉曼光谱的确“靠谱”( 三 )

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图3-25℃甘油溶液中冷冻的卵母细胞中脂滴的拉曼光谱图（图源：[1]）
注：（a）卵母细胞内明场显微镜图像；（b）有序（青色）和无序（红色）状态下脂质的拉曼图谱；（c）（b）图拉曼成像中不同代表点处的拉曼光谱， 1-有序脂滴区；2-无序脂滴区；3-细胞质。（d）C-H键拉伸区域对应光谱， 1-有序脂质、2-无序脂质、3-细胞质。
图4显示了在-25℃丙二醇溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（4a）和拉曼图（4b和4c）。 SC的差异与甘油和PG的拉曼光谱不同有关，因为甘油拉伸CH带的拉曼光谱在2890、2945сm-1处仅包含两个明显峰，而PG光谱中在2885、2940、2980сm-1处有三个峰。值得注意的是，在第二个实验中的平均脂质有序度更高，达到0.31 ，这种差异是违反常识的，因为长时间暴露于低温有助于相变达到更稳定状态，因此，第一个实验应该具有更高的脂质有序度，而这种脂质有序度偏差的原因可能是实验中卵母细胞的来源不同，或者测量中使用的两个卵母细胞是在不同时间、不同的猫获得的，因此可能具有不同的脂质含量；另一个原因可能来自NMF-ALS方法的系统误差，可以注意到，光谱分量SOL和SDL在图3和图4中也有所不同。

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图4在-25℃PG溶液中冷冻的猫卵母细胞中脂滴的拉曼图（图源：[1]）
注：（a）冷冻卵母细胞的明场显微镜图像，矩形为用拉曼光谱研究的区域；(b)有序（IOL青色）和无序（IDL ，红色）状态下的脂质拉曼图；(c)η的空间分布；(d)多变量分析得出的拉伸CH区域中的光谱成分（SOL–有序脂质， SDL–无序脂质， SC–细胞质）；(e)脂质有序度η分布直方图。
3、拉曼光谱用以监测冷冻卵母细胞内脂质相状态变化
为评估脂质相状态的变化，研究中定义了脂质有序度：η=IOL/（IDL+IOL) 。对所有光谱中脂质强度超过最大值的20%（图5）进行统计。图中脂质有序度分布广泛，可以使用正态分布来描述，其平均值η=0.18 ，这种分布的单峰性表明脂质处于有序和无序状态的区域逐渐分离（图5a）。图5b所示的η的空间分布证明了从0到0.4不等的具有不同脂质有序度的脂质共存， η的中间值可能由于深度分辨率不足以检测隐藏在某类脂质有序度脂质后的其它有序度脂质。

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图5图2所示拉曼图的η直方图（a）和空间分布（b）（图源：[1]）
4、“指纹区”拉曼光谱成像揭示脂滴内部不饱和脂质分布
通过测量1000-2000cm-1的“指纹”光谱区域，虽然脂质在该区域的拉曼光谱特征峰比CH拉伸带的峰强度低了约4倍，但是该指纹区域却包含了更多物质的拉曼谱带可以提供其它化学成分的有效信息。
研究发现，有序相状态的脂质会分布在LD的边界上，并形成环状结构，而无序状态的脂质主要位于LD的内核中。在图6a（见标记区域）中，可以识别出至少10个具有环状结构的LD 。研究以1660cm-1位置处的不饱和脂质中C=C键和1745cm-1的C=O键比值表示不饱和脂质度的空间分布，由图6中的可视化结果显示，其平均IC=C/IC=O比率为6.05 ，对应于每个烃链约1.2个双键（图6b）。拉曼光谱对三个组分的分解并表征有序脂质、无序脂质和细胞质蛋白与冷冻保护剂混合物的贡献（图6c）。 IC=C/IC=O比率从5（每条链约1个双键）到6.8（每条链约1.35个双键）（图6d），分析结果与实际预估一致。