小奕说药 │ 产品和工艺开发生命周期中HCP分析方法开发策略( 二 )

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图2.USP<1132>哺乳动物HCP抗原制备的典型过程
3.2.3.HCP质量分析
在动物免疫前应对HCP质量进行分析：制备抗原的总量；免疫测定或质谱分析等方法确认HCP抗原无任何产品污染；通过1-D或2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳确定存在尽可能多的HCP蛋白。
HCP抗原同时也作为标准品使用，因此还要确保：生产量应足够大，以提供多年（通常为10-20年）库存；抗原制备过程应详细记录，以便于后期再生产时的回溯；HCP抗原组成也应足够全面，以耐受产品生命周期内的工艺制造变化；HCP标准品应进行稳定性监测，避免发生降解。
3.2.4.抗HCP抗体的制备
由于制备的抗HCP抗体使用期限可能较长（例如产品或平台的预期生命周期较长），因此所制备的抗体应尽可能多。由于CHO为哺乳动物细胞，因此使用在系统发育树上离哺乳动物更远的物种（如鸡）有助于产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体，有助于提高抗体覆盖率。在免疫接种之前，应确认动物是否对产品药物存在预先免疫抗体，应排除反应阳性的动物。
每只动物可进行多次增强免疫，以产生高滴度、高亲和力抗体。低分子量HCP抗原往往免疫原性差，也可单独收集低分子量HCP抗原，然后实行不同的免疫策略以增强免疫效果。
在合并抗血清前应对每个个体的血清进行滴度或Westernblot分析，以筛选和去除低滴度、仅对部分HCP具有免疫反应以及非特异性结合的抗体。最终获得的抗体库也应证明HCP的覆盖率与专属性。

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图3.USP<1132>不同纯化方法的优缺点
#3.3HCP抗体的覆盖率研究
覆盖率评估方法有两种：二维电泳结合蛋白质免疫印迹（2-DWesternblot）或免疫亲和捕获。 USP<1132>对抗体覆盖率评估的2种方法进行了对比（图4）。

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图4.二维电泳结合蛋白质免疫印迹与免疫亲和二维电泳方法比较
3.3.1.2-DWesternblot
使用两块同样的胶对同一样品进行二维电泳，其中一块进行Westernblot显色，另一块用银染/荧光染色；再用软件匹配分析两块胶中的蛋白质点，计算覆盖率水平（图5）。该方法操作较为简便，但是重复性差、数据比对分析困难；且方法中HCP处于变性条件下，与ELISA检测中的HCP的天然状态不同（图6）。

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图5.2-DWesternblot覆盖率分析流程图

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图6.USP<1132>覆盖率对比图示
图：CHOHCP的2-DSDS-PAGE荧光染料染
色
右图：与左图相同样品的Westernblot分析
3.3.2.免疫亲和二维电泳
免疫亲和二维电泳是基于免疫层析柱和二维电泳的方法。首先将HCP抗体偶联到层析填料上，然后上样HCP样品，过程中HCP抗体可捕获识别的HCP ，而未识别的HCP则会流穿，最后洗脱富集HCP 。分别将捕获前和捕获后HCP进行二维电泳银染分析，计算抗体的覆盖率（图7）。

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图7.免疫亲和二维电泳流程图
3.3.3.免疫亲和-液相质谱（LC-MS/MS）分析
在免疫亲和的基础上，也可使用LC-MS/MS进行覆盖率分析，并且可以定量分析HCP 。 LC-MS/MS方法有几个优点：
1.可以在产品开发的早期鉴定潜在的高风险HCP（图8）；
2.可以确定单个HCP的相对水平。但由于最终产品中的单个HCP水平非常低，对此方法的灵敏度提出了非常高的挑战。