小奕说药 │ 产品和工艺开发生命周期中HCP分析方法开发策略( 三 )

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图8.一些潜在的高风险HCP
HCPELISA分析方法验证
由于HCP抗原和对应的抗体均有上千种，且HCP种类和数量随纯化步骤而减少，这对HCP免疫分析方法的验证提出了挑战。对于中间过程样品的验证，重点是方法准确度（加标回收率）、稀释线性和精密度。针对最终产品应从准确度、精密度、稀释线性、专属性、定量限等多方面进行考察。下面对ELISA方法验证中需要有针对性考虑的问题进行讨论。
#4.1定量限
ELISA定量限往往能做到ng/mL水平。首先向连续稀释的DS的溶液中添加10ng/mL的HCP标准品。加标回收率可设为70%-130%（定量限处的加标回收率可设为50%-200%），计算满足要求的DS最小的稀释倍数。第二步，在最小稀释倍数下加不同浓度的HCP标准品，回收率应为70%-130%（定量限处的加标回收率可设为50%-150%），符合上述要求的最低浓度即为定量限。结果通常需满足由不同人员、不同天开展的至少三次实验均合格。
#4.2样本稀释线性
在HCP免疫测定中，由于包被在96孔板中的抗体数量一定，部分HCP含量可能会超过HCP抗体的量，在HCP抗体饱和的情况下，数据会失真；且免洗ELISA检测方法在高浓度HCP时，会存在Hook效应。因此在反应中HCP的量应低于抗体的量。某些情况下，方法灵敏度有限，即使样品连续稀释到定量限时也未观察到线性。在这种情况下，应报告验证范围内的最高HCP值。稀释结果的非线性并不罕见，一般认为是抗体数量不足，但也有其他潜在原因，例如抗体与产品的反应或基质干扰、存在非特异性抗体以及产品中存在HCP聚集等。
其他常用的HCP检测、定量和表征分析方法
HCP可用多种方法进行检测。除了最常见的ELISA外，其他常用的电泳方法有1-DSDS-PAGE、2-DSDS-PAGE以及CE-SDS等；常用的免疫印迹方法有1-D/2-DWesternblot；色谱方法有反相色谱法和蛋白组学方法。
随着对产品中HCP种类的认识逐渐丰富，可以进行特定的蛋白质风险评估，并在必要时对特定HCP杂质进行检测。例如，开发定量HPLC-MS/MS方法，对特定HCP的肽段进行定量分析。
讨论
由于HCP的异质性，并非每种HCP在动物中都能产生抗体，高免疫原性的HCP所产生的抗体较多，通常在ELISA信号中占主导地位，而低免疫原性的HCP没有足够的抗体来识别它们。因此HCP检测读数为所有HCP的“免疫加权” 。尽管如此， ELISA法能够测定最为广谱的HCP ，是行业内最常用的HCP检测方法。作为补充，传统的HCP检测方法（例如1-D/2-DSDS-PAGE）仍然是HCP表征的有用工具。由于HCP检测的复杂性，需要根据产品生命周期选择合适的检测方法，开发者应进行充足的表征研究，进行必要的方法验证，满足监管方要求，确保患者的安全。
参考文献
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