小奕说药 │ 产品和工艺开发生命周期中HCP分析方法开发策略

前言
生物制品中来自生产细胞系自身的蛋白成分被称为宿主细胞蛋白(HostcellProtein ， HCP) 。 HCP组成复杂，既包含细胞分泌蛋白，也包括结构蛋白。由于种类繁多，这些蛋白的理化性质，如等电点、疏水性、相对分子质量等往往具有明显差异。 HCP可能影响产品使用的质量，例如：可能会引起病人的免疫应答或过敏性反应；可以引发生物制品的聚集或片段化；促进聚山梨酯的降解，产生含有降解产物的可见异物。
因此生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性(CQA) ，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。
法规
在美国、欧盟以及各国法规中，均将HCP定义为工艺相关杂质。相关指南指出，应通过使用适当的、受控的制造工艺将其水平降至最低。 ICHQ6B指出，生物制品制造商应评估可能存在的杂质，并根据临床前数据和临床经验制定杂质的质量标准。在最终产品的残留量限值中，中美的推荐限度值均在0.01%以下。
HCPELISA分析方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法，该方法具有操作简便、快速、高通量等特点。在USP<1132>和EP<2.6.34>中，从抗原抗体制备、方法开发、抗体表征和方法验证等多方面对宿主细胞蛋白检测方法进行了详细的表述。
#3.1开发周期
常见的HCPELISA分析方法开发计划，应根据项目所处的不同阶段而定。在产品开发时选择商品化HCP试剂盒，该分析方法通常可使用至临床二期（图1A）。临床三期及以后，应优选平台工艺HCP方法或上游工艺专属HCP方法。如果希望将商业化试剂盒应用于临床三期和上市后，则应充分证明试剂盒中主要试剂（如标准品、抗体等）适用于本工艺的HCP检测。考虑到试剂盒来自外部供应商，生物制品生产方对其控制较少，当关键试剂（如抗体）更换时，应当证明更换前后的方法一致性。
平台工艺HCP方法是指使用公司特定的宿主细胞株，按照上游平台工艺生产的HCP标准品和对应抗体所开发的检测方法。当一个项目在上游条件相似时可用相同方法进行HCP检测。图1B表明，如果在产品开发时已有基于平台工艺的HCP方法，则此方法可用于产品开发的所有阶段。如果细胞培养工艺与平台工艺发生显著变化，并且可能引入显著不同的HCP群体，则在临床三期/工艺验证之前需要切换到专属HCP方法。

文章图片
图1.USP<1132>产品开发不同周期HCP分析方法的选择策略
A：在产品开发时选择商业化试剂盒
B：在产品开发时选择平台HCP分析方法
#3.2HCP抗原制备
3.2.1.空载细胞培养
使用空载质粒转染的生产细胞系,在接近于生产工艺的细胞培养条件下生成HCP 。通常使用细胞池而不是单克隆培养的好处是更多的变异性可以产生更多的HCP 。
由于细胞活率、代谢和密度的变化都可能改变抗原的HCP谱，因此可以略微更改细胞培养来产生不同的HCP组合（例如，允许发酵时间更长、人为改变培养条件及降低细胞存活率等），以获得更宽的HCP谱。
HCP抗原可以从代表性的小规模、中试规模或生产规模中产生。中试或生产规模可以最好地模拟实际工艺。然而，如果仅应用一次大规模生产，可能无法反映细胞培养过程中的正常变化；相反，可以合并几个小规模生产，以更好地反映细胞培养过程不同引起的变异性。
3.2.2.HCP收获
HCP抗原可以从细胞裂解物、HCCF或两者的混合物中制备，如图2所示。如果抗原从HCCF制备，则可以延迟收获细胞，以允许更多细胞裂解并释放HCP ，从而拓宽HCP谱。上游发酵工艺结束后，对所得HCP抗原进行最小程度的处理，以减少HCP的损失。通常选择与实际下游生产工艺相同或相似的HCCF步骤去细胞碎片，然后通过超滤/渗滤处理HCCF ，置换缓冲液（例如PBS或HEPE）并浓缩。应尽量减少过滤滤膜对HCP的损失，例如使用10kDa或更小分子量截留的滤膜。