金坚团队：首个靶向AKT变构位点的PROTAC( 二 ) _健康小知识

近年来，研究人员已经开发了多种靶向活性位点的AKTPROTAC（图3），其中， MS21是已报道最有效的AKT降解剂，然而MS21不能有效诱导携带KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解。为了克服MS21等靶向活性位点PROTAC在携带KRAS/BRAF突变的癌细胞较差的降解AKT能力。作者另辟蹊径，试图从AKT的变构抑制剂切入，开发新型的靶向变构位点的AKT降解剂。

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图3.已报道的靶向活性位点的AKTPROTAC
下面让我们一起走进这篇文献：
1.基于ARQ-092PROTAC的设计思路及合成
研究表明，与ATP竞争性结合的AKT活性位点抑制剂优先结合激活的AKT（磷酸化的AKT ， p-AKT）。由于在KRAS/BRAF突变的肿瘤细胞系中，磷酸化AKT蛋白水平较低，这就影响了与ATP竞争性结合的活性位点抑制剂的效果，从而导致耐药。
与靶向活性位点抑制剂不同， AKT变构抑制剂可以结合并稳定AKT的失活形式。因此，靶向AKT变构位点的PROTAC有可能在含有KRAS/BRAF突变的癌细胞中参与结合失活的AKT ，这就可能诱导MS21耐药肿瘤细胞系中AKT的降解。
首先，作者选取了AKT变构抑制剂ARQ-092作为AKTPROTAC的靶头化合物，随后通过对ARQ-092与AKT1的晶体复合物进行分析，作者发现ARQ-092中的左侧苯环伸向溶剂区（图4）。因此，作者选用该位点作为连接位点进行衍生化，分别合成了末端是羧基和氨基的化合物1（末端羧基）和2（末端氨基）。随后，作者基于化合物1和2开展PROTAC合成工作。

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图4.ARQ-092与AKT1的晶体复合物及化合物1和2的化学结构
VHL配体VHL-1和CRBN配体泊马度胺是最常用的两种E3泛素连接酶配体。作者同时采用这两种E3配体，分别合成了基于VHL配体和CRBN配体两种类型的AKTPROTAC 。
最先开展的是基于化合物1（末端羧基）的PROTAC合成（图5）。其中，化合物3-20是基于VHL配体的PROTAC ，作者分别合成了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种类型PROTAC 。同时作者也合成了基于泊马度胺的PROTAC21-32 ，同样采用了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种连接链类型。

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图5.基于化合物1的AKTPROTAC
接下来，作者合成了基于化合物2（末端氨基）PROTAC33-61（图6）。其中，化合物33-49是基于VHL配体的PROTAC ，化合物50-61是基于泊马度胺的PROTAC 。并且作者同样也考察了不同长度的聚乙二醇和烷烃链的连接链类型，其中化合物33-41和57-61是聚乙二醇类型的PROTAC ，化合物42-49和50-56是烷烃链类型的PROTAC 。

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图6.基于化合物2的AKTPROTAC
2.PROTAC蛋白降解能力初筛实验
接下来，作者在PC3细胞系（人前列腺癌细胞）上筛选合成的PROTAC3-61对AKT蛋白的降解能力（图7）。蛋白降解实验表明基于VHL配体的PROTAC比基于泊马度胺的PROTAC具有更强的降解能力，且烷烃链比聚乙二醇链更有效。作者从构效关系研究发现了PROTAC20、48和49具有较强的AKT降解能力，并可以有效抑制下游信号传导，如：p-akt、p-pras40和p-s6 。

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图7.化合物3-61的蛋白降解实验
3.基于最优化合物20的进一步结构优化及后续生物活性研究
有研究表明， VHL-2（VHL-1中苄位甲基取代的结构）对VHL具有更高的亲和力。因此，作者选用了降解活性最好的PROTAC20进行进一步结构改造，将20中的VHL-1替换成具有更高亲和力的VHL-2 ，得到了PROTAC62 。作者也分别合成了化合物63和64作为阴性对照化合物（图8）。