经验分享：活细胞RNA成像技术及其在生物医学中应用研究进展( 二 )

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图1MS2/MCP系统成像技术原理示意图
融合表达荧光蛋白的MCP二聚体与MS2茎环结合实现RNA成像.MCP：MS2衣壳蛋白.
Figure1SchematicdiagramofMS2/MCPsystem
1.1.2
Larson等[13]基于假单胞菌RNA噬菌体的PP7开发了PP7/MCP系统（图2），其标记RNA的原理与MS2/PCP系统相同。噬菌体PP7的外壳蛋白与其同源RNA结构具有较强的亲和力[34] 。研究者使用PP7/PCP系统来研究酵母细胞内新生RNA的动力学，包括mRNA转录起始、伸长和终止。 Li等[35]利用PP7/PCP系统在秀丽线虫中对mRNA在细胞内的定位和转运过程进行高时空分辨率跟踪。 PP7/PCP系统与MS2/MCP系统联用可实现在单个细胞中RNA的双色标记，从而同时对多种RNA进行成像跟踪[36] 。此外，与MS2相比， PP7茎环与PCP结合效率较高，因此提高了RNA标记的信噪比[37] 。

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图2PP7/PCP系统成像技术原理示意图
融合表达荧光蛋白的PCP二聚体与PP7茎环结合实现RNA成像.PCP：PP7衣壳蛋白.
Figure2SchematicdiagramofPP7/PCPsystem
1.1.3
boxB/λN22系统由Daigle和Ellenberg开发，并首先在哺乳动物细胞中应用[14] ，其主要基于λN22蛋白与15ntboxBRNA茎环结合进行RNA标记（图3）。 RNA结合蛋白和适配体尺寸小是该系统的优势，有利于减少对所标记RNA特性的影响。 boxB/λN22系统是仅次于MS2/MCP及PP7/PCP的第三位常用系统，可以提供mRNA及其转运分子在细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞中各种生命过程中动态行为的相关信息[14 ， 38-40] 。

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图3boxB/λN22系统成像技术原理示意图
融合表达荧光蛋白的λN22单体与boxB茎环结合实现RNA成像.
Figure3SchematicdiagramofboxB/λN22system
1.1.4
CRISPR-Cas系统主要运用于DNA和RNA编辑领域。通过改造Cas蛋白，使其无法剪切核酸分子但仍保留与DNA或RNA的结合能力，从而实现DNA和RNA的成像。 dCas9（来源于化脓性链球菌）通过与GFP融合，借助一条称为PAMer的寡脱氧胸腺苷酸，能够识别并结合内源性mRNA ，从而实现RNA成像[41] 。 PAMer与靶向的单链mRNA结合，产生了PAM位点，巧妙地让dCas9识别并结合RNA 。 CRISPR-Cas13是近期被鉴定为RNA引导及RNA靶向的核糖核酸酶蛋白家族，包括Cas13a[42]、Cas13b[43]、Cas13c[43]、Cas13d[44]、Cas13X.1[45]和Cas13bt[46] 。 CRISPR-Cas13已经在哺乳动物细胞中实现了精确的RNA靶向和编辑[42 ， 45-46] 。 CRISPR/dCas13也在活细胞中被应用于RNA成像[16]（图4）。通过crRNA介导，融合荧光蛋白的dCas13b蛋白结合靶RNA从而实现RNA标记。 Yang等[16]测试了dCas13a、dCas13b及dCas13d等多个系统，发现dPspCas13b标记RNA的效率较高且具有特异性，其次是dPguCas13b 。 crRNA靶序列的长度在20~27nt间较为有效。 CRISPR-dCas13b系统成像RNA的优势是不需要对基因组进行编辑，其不足之处是crRNA的结合效率不确定。标记一条特异的RNA需要设计并构建多个crRNA ，能富集的荧光蛋白分子数也较为有限。因此，提升RNA标记的信噪比是CRISPR-dCas13系统的主要挑战。

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图4CRISPR/dCas13系统成像技术原理示意图
在crRNA介导下，融合表达荧光蛋白的dCas13蛋白靶向RNA ，实现RNA成像.CRISPR:成簇的、规律间隔的短回文重复序列；crRNA：CRISPRRNA；dCas：失活的Cas.
Figure4SchematicdiagramofCRISPR/dCas13system
1.2
荧光染料由于灵敏度高、操作方便，逐渐取代放射性同位素作为检测标记广泛应用于荧光探针和细胞染色等。荧光RNA适体是折叠成可以结合特定靶标的特定三级结构寡核苷酸。适体（DNA、RNA或蛋白质）可以与配体（如染料分子）结合，具有非常高的特异性。这些染料分子通常不发荧光，但在结合同源适体时会产生明亮的荧光信号，从而有利于提高RNA标记的信噪比[47] 。