经验分享：活细胞RNA成像技术及其在生物医学中应用研究进展

细胞内的生命活动依赖于蛋白质和RNA 。 DNA通过转录生成多种协同工作的RNA 。其中非编码RNA参与催化、调节功能以及结构组成，而mRNA可进一步通过翻译决定蛋白合成。单细胞和多细胞生物通常依靠基因表达模式的变化来决定单个细胞的命运。因此，在分子水平上理解活细胞内RNA如何转录、剪接、转运、降解和亚细胞定位等过程具有重要的生物学意义。
RNA成像是研究RNA生物学的重要工具，主要包括固定细胞成像和活细胞成像，固定细胞的成像基于FISH[1] 。其中单分子FISH可以实现单分子RNA的成像，并对转录水平和转录本积累进行量化[2-5] 。目前单分子FISH已经能实现对全基因组范围内的转录本进行检测[6] 。最近几年开发的Slide-seq是高分辨率且保留空间信息的单细胞测序技术，能够原位研究组织样本的转录组[7] 。尽管使用这些固定细胞的RNA成像技术可以获得大量信息，但无法提供关键的时间维度，无法为基因表达调控及RNA本身的动态调控提供更全面的信息。随着显微镜和荧光标记技术的不断发展，研究者可以在活细胞中高时空分辨率地追踪单个RNA ，对RNA分子动力学进行精确量化研究[8-10] 。本综述概述了活细胞RNA成像技术的发展和运用，旨在促进活细胞RNA成像技术在生物医学领域的广泛应用。
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活细胞RNA成像可以提供不同类型细胞内RNA的表达、定位、降解、储存和调节等综合信息，对基础生物学和临床研究都至关重要。在过去二十年中，研究者开发了多种活细胞RNA成像技术，主要包括基于荧光蛋白的成像技术和基于荧光染料的成像技术（表1）。以下对具有代表性的标记技术做简要介绍。
1.1
使用荧光蛋白（如GFP）直接融合RBP来标记RNA是活细胞RNA成像的一个重大进展。本文将重点介绍使用最广泛的遗传编码的RNA报告系统。
1.1.1
MS2/MCP系统是Bertrand等[11]在1998年描述的首个遗传编码的RNA成像系统。 MS2/MCP系统为RNA加工、定位和转运提供了大量信息，是研究各种模式生物中RNA动态的最常用方法[21-25] 。噬菌体MCP与病毒RNA中独特的RNA发夹序列（MBS）紧密结合，形成病毒衣壳结构。 MCP-荧光蛋白作为二聚体可以结合MS2茎环，见图1 。研究者通过将多个重复的MS2序列插入到目标RNA中，从而实现单个转录本可视化[11] 。重复的核苷酸序列可以实现荧光信号的放大从而提高荧光成像的信噪比。然而，重复序列由于自身的不稳定可能会引起MS2序列的异常缺失和降解，从而影响RNA检测和理解其生物学功能的精确性。 Wu等[26]通过突变MBS序列中的非必需核苷酸，获得包含24个不同的MBS且中间含30nt随机接头的24×MBSV5 ，显著增强了MS2序列的稳定性，使结果分析更加准确，从而优化了MS2/MCP系统。研究表明，酵母中MCP与MS2的紧密结合以及茎环之间的短距离导致含MS2阵列的mRNA降解速度较慢，潜在影响了mRNA的寿命、亚细胞定位及表达[27-30] 。在MBSV6和MBSV7等新版本中，研究者加长了MS2茎环之间的距离。在MBSV6中，研究者用50个碱基的接头分隔每个MS2茎环；而在MBSV7中，随机接头为40个碱基[31] 。对于MBSV6 ，研究者还将茎环中一处胞苷（C）替换成尿苷（U）以减小其对MCP的亲和力，但仍保留了实时成像的单分子检测能力，这显著改善了MS2标记的靶mRNA在酵母细胞内的降解问题[31] 。 MBSV6的不足之处是光漂白快，不利于长时间成像。相比之下， MBSV7可以实现更明亮的单分子标记和更长时间的活细胞成像。另外， MBSV7/MCP不影响哺乳动物细胞内靶基因mRNA的正常降解[32] ，因此MBSV7适用于哺乳动物细胞内的活细胞RNA成像。 Xu等[33]将CRISPR/dCas9成像技术与MS2/MCP系统联用，将12个拷贝的MBSV5发夹序列与含12个dCas9识别序列的CRISPR-Tag相间排列，并将其放置于荧光蛋白的内含子中。通过将该标签插入到靶基因的氨基端或羧基端，从而实现在一个活细胞中内源基因DNA、新生RNA和蛋白的三重可视化，因此该荧光标签被命名为TriTag 。 MS2/MCP系统已经在多个物种中实现内源RNA的可视化，但其不足之处是需要对标记的RNA进行序列上的改造，这可能会导致RNA特性的潜在改变，影响标记mRNA的表达及稳定性。