经验分享：活细胞RNA成像技术及其在生物医学中应用研究进展( 三 )

1.2.1
分子信标是用于靶向内源性转录本的探针[48] 。 Tyagi等[17]开发的分子信标是发夹形的寡核苷酸杂交探针（图5），一端设计有荧光基团，另一端设计有猝灭基团。在与靶序列特异性杂交时，荧光基团和猝灭基团分离并发光。由于这些探针不能穿透细胞，而需要进行显微注射或引入，这限制了分子信标的应用。在过去的二十年中，研究人员通过优化荧光猝灭基团[49-50]和荧光基团[51-52]以及茎的结构[53]等方法改进分子信标技术，扩大了其在生物成像、基因治疗和药物递送等生物医药领域应用[54-55] 。 Chen等[56]通过分子信标技术实现了单个长链非编码RNA的定位。

文章图片
图5分子信标成像技术原理示意图
分子信标探针的两端分别是荧光基团和猝灭基团，一旦与靶RNA结合，两端分开，荧光基团发光.
Figure5Schematicdiagramofmolecularbeacon
1.2.2
通过结合DFHBI（GFP荧光基团的类似物）发出荧光的适体包括Spinach和Broccoli等。第一个为RNA成像开发的RNA-荧光基团复合物称为Spinach（以产生的绿色荧光信号命名），由Jaffrey及其同事于2011年开发[57] 。其后发现更多的染料及相应的适体对，后者均以蔬菜和水果命名，如Broccoli和iSpinach等。以上RNA适体与配体结合后才发光，有效降低了背景荧光（图6）。但其在运用上仍有局限性，如相对较低的荧光亮度和热、光稳定性，且可选荧光颜色单一，从而可能阻碍其广泛应用。
Chen等[18]开发了一系列合成染料（简称HBC），其类似于GFP的发光基团。他们通过大规模筛选与HBC结合的适体，开发了最新一代适体，命名为Pepper 。不同HBC可以发射出不同波长的光谱，因此Pepper系统是一系列具有高亮度及稳定性的RNA标记体系，具有从青色到红色的广泛发射光谱，能够与其他分子标记体系具有更好的兼容性。 HBC在游离状态下不发光，但与Pepper结合后发出的荧光强度比Broccoli等体系高一个数量级，其在活细胞中显示出良好的膜渗透性、低细胞毒性和低背景信号。 Pepper能对活细胞中的mRNA和其他RNA种类进行可靠的成像，同时对靶RNA的转录、定位和翻译的干扰较小。
Mango系统同样是由RNA的Mango适体与染料（TO1-Biotin）结合而发光。最新开发的MangoⅡ适体由于其茎环结构简单， RNA标记具有很高的信噪比，单分子RNA成像灵敏度高，可能会得到较为广泛的应用[19] 。利用Mango系统可以实现对哺乳动物固定和活细胞中三种非编码小RNA（如5S、U6）的亚细胞定位进行成像[58] 。
荧光基团-适体需要添加染料才可用于RNA活细胞成像，因此其应用受到限制，但仍是一种非常有前景的RNA成像技术，优化潜力大。

文章图片
图6RNA适体成像原理示意图
单独的染料和RNA适体都不发光，而两者结合会迸发出强烈的荧光.
Figure6SchematicdiagramofRNAaptamer

文章图片
2
RNA成像技术的发展推进了RNA领域的研究，加深了我们对RNA转录、剪接、转运、定位及成熟RNA翻译等过程的理解（图7）。以下列举了一些利用活细胞成像技术在以上领域中的研究发现（表2）。
2.1
转录是细胞以DNA为模板合成RNA的过程。在真核生物中，活细胞RNA成像及定量结果表明转录表现为一个随机过程，其特征是短时间（数分钟）的强烈活动或分散在长时间（30min到数小时）过程中的间歇式转录爆发[66-67] 。理论上，基因转录可以通过基因在转录激活（开启）和转录失活（关闭）两种状态之间切换[68-70] 。管家基因在发育过程中通过强烈调节转录爆发强度，从而在单细胞转录水平上实现更大的调节空间[12] 。转录爆发的调控主要通过调节转录爆发的持续时间或启动子启动速率（Kon）进行，而可能与转录关闭时间长短或启动子关闭速率（Koff）无关[33 ， 59 ， 71] 。 Alamos等[60]利用MS2/MCP及PP7/PCP系统进行活细胞RNA成像，分析烟草和拟南芥中热激反应基因的转录动态，结果发现植物组织通过提高可转录细胞的比率而不是增强转录强度来实现整个组织水平的基因表达上调。在各项生命活动中，细胞通过不断调整转录过程来响应细胞需求的变化。通过转录爆发行为性质的研究，可以推断其分子调控机制，爆发的频率和振幅的可调节性导致表达异质性。因此，分析转录爆发的一些关键参数，如振幅（转录强度）、频率和持续时间，可有助于理解生物在面临不同外界刺激时作出的即时转录调节的分子机制。