经验分享：如何高效表征基因治疗中腺相关病毒载体

基因治疗是通过将修饰的基因传递至靶细胞中，从而把患者体内的突变基因替换为相对应的健康基因拷贝来实现治疗或者预防疾病的目的。与传统的药物治疗相比，基因治疗是从根本上对疾病进行控制，所以有着非常好的发展前景，在世界范围内得到越来越多医药行业的关注和投入。将正常基因（外源）导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。病毒越来越多的用作载体，用于传递基因治疗的遗传物质和疫苗应用。重组腺相关病毒（recombinantAdeno-AssociatedViruses,rAAV）是基因治疗最为常用的病毒载体之一。

文章图片
一、如何开发高效安全的rAAV疗法?
为了开发通过受控和经济的制造工艺生产的高效的rAAV疗法，需要解决从病毒衣壳设计到确定最佳工艺和配方条件，再到全面质量控制的多重挑战。应对这些挑战，需要针对rAAV样品下列属性进行量身定制的分析表征：
?测定衣壳蛋白或者颗粒滴度（capsidorparticletiter）
?完整rAAV颗粒的百分比
?空-载比（Full-emptyratio）
?颗粒的粒径
?聚集体形成（aggregateformation）
?热稳定性（Thermalstability）
?基因组释放（genomerelease）
?衣壳电荷（capsidcharge）等
而所有这些都可能影响最终产品的关键质量属性（CQA）。
通常， rAAV滴度和病毒载量是使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、定量聚合酶链式反应（qPCR）、液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）、分析超速离心（AUC）和电子显微镜（EM）的技术组合测定的。这些方法通常既费时又费力，而且其准确性和精确性也值得怀疑[1] 。因此，业内越来越需求一种不依赖于使用专用试剂和昂贵的参考标准品的快速分析解决方案。
动态光散射(DLS)、多角度动态光散射（MADLS）、电泳光散射（ELS）、尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）、纳米颗粒跟踪技术（NTA）、等温滴定量热法（ITC）和差式扫描量热法（DSC）可以提供有关病毒载体的关键分析和质量属性的重要信息，从而能够对多种参数进行表征、比较和优化。
样品关键参数

文章图片
表1总结了病毒载体研究中各种重要的关键属性（CQA），以及马尔文帕纳科可以对应提供表征此类信息的各项技术。
DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC属于无标记的生物物理技术，需要最少程度的方法开发，并且可以很容易的应用于各个阶段，强化了基因治疗开发的分析工作流程。
二、高效的表征技术概念解读
动态光散射（DLS）
动态光散射(DLS)是一种非侵入式技术，可以测量由颗粒分散体系或分子溶液引起的散射光强度随时间的波动。由于进行布朗运动的颗粒或者分子的随机运动，散射光的强度会随之发生波动。使用自相关算法分析这些强度波动可以确定平移扩散系数，随后根据斯托克斯-爱因斯坦方程确定流体力学尺寸。
多角度动态光散射（MADLS）
多角度动态光散射（MADLS）通过使用三个不同的检测角度（背面、侧面和正面）并将获取的光散射信息组合成一个与角度无关（Angular-Independent）的粒径分布，从而可以对多模态的样品进行更高分辨率的尺寸测定。应用MADLS技术的扩展还可以测量出颗粒浓度（Concentration）。
电泳光散射（ELS）
电泳光散射（ELS）测定来自在电场中进行电泳的颗粒或者分子的散射光的频移（FrequencyShift），并能够计算出Zeta电位。颗粒的Zeta电位是颗粒在特定介质中获得的总电荷，可用于预测分散体系的稳定性并深入了解所研究的颗粒的表面化学。