Hydromer亲水涂层具有降低血栓形成性、细胞增殖和蛋白质吸附性( 二 )

二、材料和方法
1、材料
医用级不锈钢、电致抛光、聚氨酯管（3mmID ， 4.0mmOD）柠檬酸盐类人全血、用于免疫分析的抗体和试剂、使用96孔酶标仪用于吸光度测量。采用VHX600型数字显微镜，采用100-10003变焦镜头进行显微镜分析。蛋白质的测定采用布拉德福德法。
【Hydromer亲水涂层具有降低血栓形成性、细胞增殖和蛋白质吸附性】2、T8B配方在不锈钢和聚氨酯管中的应用
根据不锈钢和聚氨酯管协议的专用配方，对衬底进行清洗、底漆和涂层。 DualityTMT8B的配方除了含有溶剂和其他次要成分外，还包括聚氨酯预聚物、特定分子量的聚乙烯基吡咯烷酮和专有混合物中的抗菌剂。润滑性测量是根据ASTMD1894中发布的“塑料薄膜和薄膜摩擦的静态和动力学系数的标准试验方法”进行的。
简单地说，油管两端连接，油管上放置350克的重量。这个重量被来回移动了25个循环，并且滑动重量所需的力被记录下来，并与润滑性或摩擦系数成正比。经实验确定，该润滑配方的摩擦系数为0.031 ，而未涂层聚氨酯管的摩擦系数为0.922 。然而，需要注意的是，这些值是相对的，而不是绝对的，并且使用涂层不锈钢可以观察到类似的关系。
3、细胞和血液成分的粘附
柠檬酸人全血400g离心15min ，获得富血小板血浆（PRP）。小心地取出PRP ， 1000g离心10min ，然后再以2000g离心10min 。颗粒在提罗德溶液中洗涤三次，然后在提罗德溶液中重悬。通过将50-100lL重组的重组PRP颗粒放在每个不锈钢部分（1cm2）的中心或2厘米长的聚氨酯管腔内3小时，来实现表面粘附。不锈钢的每个表面最初都是用液体阻滞剂PAP笔勾画出来的，以防止液体在孵育过程中流出表面。粘附后，细胞和血小板在室温下用2%戊二醛固定20min 。
用缓冲液A（25mMTris ， pH7.4含0.15M氯化钠和0.15M0.05%Tween-20）冲洗不锈钢切片或聚氨酯管3次。非特异性蛋白结合位点在缓冲液A（缓冲液B）中室温下孵育1小时，阻断非特异性蛋白结合位点。用缓冲液A短暂冲洗后，在缓冲液B中加入100lL ，加入1：100稀释的一抗（CD15稀释、CD18稀释、CD41稀释或CD235），在48℃下孵育过夜。
对照反应在以相同方式稀释的非免疫小鼠IgG的存在下进行。第二天早上，用PBS清洗了这些表面三次。加入100微升1：1000稀释的生物素化抗小鼠IgG1：1000稀释。在室温下孵育1.5小时。采用非免疫小鼠IgG作为阴性对照。表面用缓冲液A洗涤两次，每次15min 。加入100微升亲和素偶联辣根过氧化物酶（1：1000i缓冲液A），在室温下孵育30min 。洗涤后（33,5min）后，将100lL的TMB底物（Sigma-Aldrich ，圣路易斯，莫）加入到每个切片的表面，并在室温下孵育30min 。
然后将50微升停止液混合， 15min后，记录50lL样品在450nm处的吸光度。
4、细胞培养，细胞培养物
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来自Cambrex公司（东卢瑟福，新泽西州）。简单地说，根据供应商的说明，细胞在添加了生长因子的内皮生长培养基（EGM-2）中培养。该培养基中的血清浓度为5% 。高压灭菌后，不锈钢片（1cm2）在12孔板（Fisher科学公司，波士顿， MA）中孵育，并接种83104细胞（20%融合度）。
细胞在378C和5%二氧化碳下孵育24小时后，取出碎片，用PBS冲洗，并与1mL合适的培养基一起放入新的12孔板中。我们对不锈钢切片的分析是在细胞接近融合（80%）的条件下获得的。
使用小鼠成纤维细胞的标准细胞毒性试验，指定为ISO10993（“医疗器械的生物评价-第5部分：体外细胞毒性试验”），用于评估我们的配方的细胞毒性潜力。