_pcwzy|基于微珠的多重PCR和多重ELISA-泰瑞镜下显微荧光平台简介( 二 ) 技术|泰瑞|检测|显微镜|测量

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图二
图二, 18个微珠群体的编码。微珠群体由两种不同的荧光染料以不同比例组合编码，并作为灰度值处理。微球位于微孔板孔的透明底部便于对焦。微珠不需要固定。在每个加样孔中，可同时测量多个微珠群（多参数）。微珠成像通常使用10 9/0.30物镜进行，该物镜能够对直径为6–30 微米的微珠进行成像，在相机传感器上创建直径为9个像素的图像（像素大小6.5 *6.5 微米），这对于图像处理来说是足够的分辨率。由于景深仅为2.7 微米，因此必须有自动算法进行自动对焦。理论上，每个图像覆盖670 *900 微米的区域，包含多达500个单个微珠。荧光激发的强度不是恒定的， TR-sWSI-Fluo只使用不同荧光通道之间的比率，而不是绝对值。荧光染料的比例对于每个微珠群体都是特定的。此外还有直径大小也用作分类参数。每个微珠群的表面用特定抗原/抗体/核酸修饰，用来检测样品中的不同分析物，此时使用与构成微珠的两种荧光染料不同的第三种荧光染料染色。待检测物的结合导致微珠周围出现荧光光晕（图三）。强度由图像处理算法确定。

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图三-A
图三-A. 单个微珠和其荧光标记的分析物（红色光晕）。分析物的强度在微珠的边缘进行测量或量化。微珠的身份鉴定通过其大小尺寸（直径）和荧光颜色ID得到：

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图三-B
图三-B. 七种微珠log10群体混合后的图像，密度约为700 /mm2微球数，红色外圆=阳性。直径和荧光颜色ID确保每个微珠分配给一个特定群体，且具有唯一性，使用这种方法的错误分类概率远低于1% 。如果两种染料按1:10到10:1的比例对每个微珠进行编码，则可以计算-1到+1的荧光颜色ID 。TR-sWSI-FLUO应用于多重抗体（或抗原）检测：

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图四
图四. 抗体（或抗原）微珠检测方案。将携带不同抗原的三个微珠群1、2、3固定在微孔板上。抗体（例如特异性自身，图中标记一抗）仅与相应的抗原（微珠3表面的抗原）结合。一抗由荧光团标记的二抗体识别，在微珠3表面产生不同于微球本身颜色（二种荧光的混合）的第三种荧光。TR-sWSI-FLUO应用于多重PCR：

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图五-A
图五-A. 基于微珠杂交探针的多重PCR 。 3‘’端荧光标记的单链捕获（通过核酸杂交）探针通过其5‘端’生物素与微珠表面的链霉亲和素结合。 “显色探针”在其5°端标记有有淬火剂Q（Quencher）。在没有PCR产物杂交的情况下，保留捕获探针和检测探针在溶液中，不会发生荧光能量共振转移（FRET）荧光。

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图五-B
图五-B. 基于微珠杂交探针的多重PCR 。 3‘’端荧光标记的单链捕获（通过核酸杂交）探针通过其5‘端’生物素与微珠表面的链霉亲和素结合。 “显色探针”在其5°端标记有有淬火剂Q（Quencher）。当PCR扩增产物随着PCR反应进程其数量增加时， “显色探针”和捕获探针与PCR扩增产物杂交，捕获探针3‘端’的荧光标记和显色探针5‘端的Q被安置在一起’而产生的FRET荧光（不同于微球和单链捕获探针3‘端’的荧光）